Name: low-density primary hippocampal neuron culture
Uploaded: 2017-04-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 17 min 46 s
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Este trabalho foi financiado pelo CIHR MOP-142209 para TJS.

Todos os experimentos e protocolos que utilizam animais de laboratório foram aprovados pela Universidade de Manitoba comitê de ética animal e estavam em conformidade com as diretrizes do Canadian Council on Animal Care. 1. Preparação de Instrumentos, Tampões e Soluções <ol><li> Esterilizar por autoclavagem de todos os equipamentos de dissecção, pipetas de Pasteur de vidro, pontas de pipetas, aparelho de filtro, e água desionizada. </li><li> Prepara-se uma a 20% (w / v; 1,1 M) uma solução de glucose estoque em água desionizada e filtra-se a esterilizar. Armazenar a 4 ° C. </li><li> Prepara-se uma solução de piruvato de sódio 100 mM em água desionizada e filtra-se a esterilizar. Armazenar a 4 ° C. </li><li> Prepare a Solução Salina Equilibrada de cálcio e magnésio livre de Hank (CMF-HBSS) por preparação de uma solução de 10% de HBSS (10x), HEPES a 10 mM, e 100 U / mL de penicilina-estreptomicina, em água desionizada. Armazenar a 4 ° C durante não mais do que 1 a 2 meses. </li><li> Prepare a 10 mg / mL de desoxirribonuclease I (ADNase) em CMF-HBSS,e em seguida filtrar-esterilizar e armazenar a -20 ° C. </li><li> Preparar o meio da glia por preparação de uma solução de glicose a 30 mM (a partir da solução estéril), 95 U / mL de penicilina-estreptomicina, e soro de crescimento bovino de 10-15% (BGS) em Meio Essencial Mínimo (MEM). NOTA: Como indicado no protocolo, uma solução de 5% BGS pode ser usado, se necessário para retardar a proliferação das células. Soro de Cavalo pode ser usado em vez de BGS, mas notar que cada lote deve ser verificada antes da utilização, devido à variação inter-lote. Armazenar a solução preparada a 4 ° C durante não mais do que 1 a 2 meses. Embora muitos laboratórios usam FBS, observou-se consistentemente que o crescimento glial na BGS é tão robusto como em FBS. BGS é derivado a partir de soro de vitela fetal, que é suplementado com componentes quimicamente definidos. Além disso, BGS é substancialmente mais económica do que FBS. </li><li> Prepara-se o crescimento do neurónio e meio de manutenção (Neurobasal-B27, NBG) por preparação de uma solução de 1x suplemento B27 e 0,5 mM de L-glutamina em 500 ml Neurobasal Medium. Armazenar a 4 ° C durante não mais do que 1 a 2 meses. L-glutamina pode ser substituído com Glutamax, que tem sido sugerido para ser mais estável no meio de crescimento. </li><li> Prepara-se o neurónio plaqueamento médio por preparação de uma solução de glicose a 30 mM (a partir da solução estéril), piruvato de sódio 1 mM (a partir da solução estéril), e 10% BGS em MEM. Armazenar a 4 ° C durante não mais do que 1 a 2 meses. </li><li> Prepara-se uma solução de 1 mM de citarabina (Ara-C) e filtra-se a esterilizar. Aliquota em porções de 1 ml e armazenar a -20 ° C. </li><li> Prepara-se uma solução de APV 100 mM em NaOH 100 mN filtro-esterilizado. Armazenar a -20 ° C. </li><li> Dissolve-se 1 mg / mL de poli-L-lisina em tampão de borato, pH 8,5 (ácido bórico 50 mM e borato de sódio 12 mM) e filtro a esterilizar. Alíquotas e armazenar a -20 ° C. Em vez de poli-L-lisina, pode-se utilizar a poli-L-ornitina, que podem ser menos tóxicos para as células. </li></ol> 2. Preparação Cultura Glia <ol><li> Prepare a cultura de células astróglia cortical <ol><li&gt; Obter filhotes de rato dentro de 24 h após o nascimento. Coloque os filhotes no gelo para anestesiar-los. </li><li> Pulverizar as crias com 70% de etanol e decapitar-los. </li><li> Coloque as cabeças em uma placa de 100 mm no gelo contendo 15 mL de CMF-HBSS. </li><li> Dissecar cada cérebro através do corte do couro cabeludo, a abertura do crânio, cortando o tronco cerebral, e então transferindo o cérebro para 60 mm de placas de Petri em gelo contendo 3 mL de CMF-HBSS. </li><li> Separa-se os hemisférios cerebrais do hipocampo e em seguida retiram as meninges circundantes eles. Exercer as devidas precauções para garantir contaminação mínima a partir de fibroblastos meninges. fibroblastos meninges na cultura pode competir com glia para o crescimento e ser prejudicial para o neurônio saúde. Recolher todos os hemisférios cerebrais em um prato de 60 mm Petri sobre gelo contendo 5 mL de CMF-HBSS. </li><li> Remova a CMF-HBSS e depois picar o tecido cortical coletadas tão finamente quanto possível, utilizando micro-dissecando primavera-tesoura. </li><li> Adicionar suficiente CMF-HBSS para o choptecido ped. Usando uma pipeta de pasteur de vidro, transferir os pedaços de tecido para um tubo de 15 mL. Levar o volume total a 12 ml por adição de CMF-HBSS. </li><li> Adicionar 1,5 mL de cada vez de 2,5% de tripsina e 10 mg / mL de solução de DNase. Incubar a mistura resultante a 37 ° C num banho de água durante 12 min. </li><li> Tritura-se o tecido de 10-15 vezes utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro, e incuba-se ainda mais num banho de água a 37 ° C durante 3 min. </li><li> Filtra-se o sobrenadante através de papel de lentes, ou uma malha de filtro para um tubo de 50 mL contendo 5 mL de BGS. Isto é feito para remover pedaços de tecido não dissociado. Alternativamente, usar filtros celulares disponíveis comercialmente. </li><li> Adicionar 13,5 mL de CMF-HBSS e 1,5 mL de 2,5% de tripsina para o tubo contendo os pedas de tecido remanescentes e incubar ainda mais a 37 ° C num banho de água durante um adicional de 10 min. </li><li> Tritura-se o restante tecido mais uma vez, e depois filtra-se a suspensão outra vez para dentro do tubo de 50 mL contendo o filtrado inicial. Em seguida, enxaguar a lepapel ns com 3 mL de BGS. O volume final deve ser de aproximadamente 38 ml. </li><li> Centrifugar a suspensão contendo as células gliais dissociadas durante 6 minutos a 130 x g. Cuidadosamente descarte do sobrenadante utilizando uma pipeta Pasteur de vidro. Certifique-se que as células peletizadas na parte inferior não sejam perturbados. A parte inferior do pelete aparece ligeiramente avermelhada contendo componentes do sangue. </li><li> Transferir as células gliais em 1 ml de meio da glia para um tubo fresco, tendo o cuidado de não perturbar a porção avermelhado do pelete. </li><li> Adicionar-se a 2 mL de meio de glial por cachorro para ressuspender o combinado dissociadas de células da glia. Por exemplo, foram usadas se 10 filhotes, e, em seguida, o volume total de ressuspensão seria de 20 mL. </li><li> Preparar um frasco de cultura celular de 75 cm2 por filhote. Adicionar 18 mL de meio glial pré-aquecido a cada frasco. </li><li> Transferência de 2 ml de suspensão de células em cada balão e incubar em 37 ° C, 5% de CO2. </li><li> Após um dia, substituir com 20 mL glial medium. Nesta fase, a cultura é uma mistura de glial e outros tipos de células indesejadas. </li><li> Quatro dias após a semeadura das células, agitar vigorosamente os frascos para desalojar as células não-astrócitos. Para fazer isso, lavar os balões uma vez com CMF-HBSS, e, em seguida, adicionam-se 10 ml fresco CMF-HBSS a cada frasco. Agitar vigorosamente os frascos de 5-10 vezes, e em seguida, aspirar para fora da CMF-HBSS. Lavar duas vezes com CMF-HBSS, e, em seguida, adicionar 20 mL de meio de glial. NOTA: Este passo é crucial para assegurar a remoção de tipos de células não-alvo, e não deve resultar na perda dos astrócitos desejados. </li><li> Substituir com meio glial fresco duas vezes por semana até que as células estão confluentes (Figura 1). </li></ol></li><li> congelamento glia <ol><li> Uma vez que as culturas são confluentes, aspirar fora o meio e lava-se a monocamada de células com 10 mL de CMF-HBSS. </li><li> Adicionar 10 mL de 0,25% de tripsina / EDTA a cada bal e incubar a 37 ° C durante 3 min. </li><li> Toque em frascos suavemente para desalojar as células. Adicionar 1 mL BGS tO cada balão e transferir as suspensões de células em tubos de 15 mL. </li><li> Centrifugar os tubos a 130 xg durante 6 minutos. Descartar o sobrenadante resultante. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 2 ml de meio glial. </li><li> Prepara-se o meio de congelação da glia (dimetilsulfóxido 1-parte e 4 partes BGS). Adicionar 0,5 mL desta solução a cada uma de 4 frascos criogénicos por frasco. </li><li> Transferir 0,5 mL da suspensão de células de cada frasco, e, em seguida, congelar as células lentamente colocando os frascos em um recipiente isolado em um congelador a -80 ° C durante a noite. Após um dia, transferir os tubos de ensaio para um congelador de azoto líquido para o armazenamento a longo prazo. </li></ol></li><li> Chapeamento reviveu glia <ol><li> glia placa 1-2 semanas antes do dia neurónio cultura. </li><li> Preparar um tubo de 50 mL com 10 mL de meio aquecido glial. </li><li> Descongelar uma ampola congelada de células da glia em um banho de água a 37 ° C durante 2-3 min. </li><li> Transferir o conteúdo do frasco para dentro do tubo de 50 mL contendo 10 mL de meio de glial. </li><li> centrífugae o tubo durante 5 min a 130 xg e o sobrenadante aspirado fora. </li><li> Ressuspender o sedimento em 20 mL de meio de glial. </li><li> Adicionar 3 ml de meio fresco glial a cada um dos pratos de cultura (60 mm), e, em seguida, transferir 1 ml da suspensão de células a cada prato. Incubar as culturas em 37 ° C, 5% de CO2. </li><li> Alimentação das células duas vezes por semana. Se a densidade de células atinge% de confluência 50 bem antes do dia neurónio cultura, mudar para meio contendo 5% de células gliais BGS para retardar a taxa de crescimento da glia. A confluência desejado da monocamada de células gliais para neurónio cultura é de 50% - 70%. </li><li> Substituir o meio com meio glial BNG (6 mL / prato) 1-2 dias antes da cultura neurónio. </li></ol></li></ol> 3. Preparação Lamela <ol><li> Limpeza e preparação de parafina Beads <ol><li> Submerge lamelas em ácido nítrico concentrado (70% p / p; CUIDADO: altamente corrosivo) e sonicar-los durante 30 min à temperatura ambiente. Outros laboratórios têm found que é benéfico para incubar as lamelas em ácido nítrico a 70% em prateleiras de cerâmica durante 12-24 h à temperatura ambiente em vez disso. </li><li> Cuidadosamente descartar o ácido nítrico numa hote química, designada de acordo com as orientações institucionais. Lavam-se as lamelas 3-5 vezes com água desionizada. </li><li> Submergir as lamelas em água desionizada e sonicar-los de novo durante 30 min (saltar se a seguir o método alternativo). </li><li> Remover a água desionizada e enxaguar as lamelas mais três vezes. </li><li> Submergir as lamelas em 50 mL de água desionizada e esterilizá-los por autoclavagem. Alternativamente, esterilizar as lamelas a 225 ° C num forno durante 6 h. Se utilizar esta abordagem alternativa, pule para o passo 3.1.9. </li><li> Uma vez autoclavado, transferir as lamelas a uma câmara de fluxo laminar estéril para os passos seguintes. </li><li> Remover a água desionizada e enxaguar com 20-30 ml de etanol a 100%. </li><li> Adicionar 20-30 mL de etanol a 100% e transferir as lamelas eetanol para uma placa de Petri de 100 milímetros. </li><li> Use pinças rombas para transferir lamelas de 60 mm de placas de Petri, 4-5 lamelas por placa, e, em seguida, permitir-lhes secar ao ar, inclinando-se as lamelas de cobertura contra a borda do prato. Uma vez que o etanol se ter evaporado, colocar as lamelas sobre a superfície. </li><li> Transferir 10 g de parafina para um frasco de vidro resistente ao calor apropriado. Derreter a parafina e mantê-la a cerca de 150-200 ° C, numa placa quente durante pelo menos 1 h. A temperatura ideal para que a parafina deve ser aquecida pode demorar alguns ajustes. temperaturas não ideais pode levar à dificuldade em produzir o tamanho correto das esferas de parafina. O período de espera após fusão ajuda a garantir que a temperatura consistente em todo o líquido. </li><li> Mergulhar uma pipeta de Pasteur, em que a parafina, e, em seguida, rapidamente tocá-lo para três pontos perto da borda de cada lamela (cada local sendo de aproximadamente 120 °). As gotas irá solidificar em pérolas de cerca de 0,3-0,5 mm de altura e 1,0-2,0 mm de diameter e funcionam de modo a proporcionar um espaço entre os neurónios sobre a lamela e a monocamada de células gliais abaixo (Figura 2). </li><li> Esterilizar os pratos sob luz UV durante 30 min, e em seguida cobrindo-os com folha de alumínio e armazenar à temperatura ambiente. lamelas preparados podem ser armazenados e utilizados por até um mês. contas de parafina devem ser autorizados a aderir as lamelas por pelo menos uma semana antes do uso. Isso vai impedir que a parafina se desprendam durante os passos restantes do protocolo. </li></ol></li><li> As lamelas de revestimento com poli-L-Lisina <ol><li> Obter placas de Petri contendo lamínulas previamente preparadas com as contas de parafina. </li><li> Adicionar 200 ul de poli-L-lisina em tampão de borato para a superfície de cada lamela e deixar a solução sentar sobre as lamelas durante a noite, tapada, à temperatura ambiente. Cubra a mesma superfície que aquele em que as contas de parafina estão situados. Observe que, se devidamente limpo, a poli-L-lisina deve se espalhar facilmentepara cobrir a superfície da lamela. </li><li> Após um dia, lava-se as lamelas duas vezes por imersão em água desionizada estéril durante 2 horas de cada vez. Após a lavagem final, substituir a água com 4 ml de meio de plaqueamento neuronal por prato. Note-se que é importante que a superfície das lamelas não ser deixada secar, depois de ter sido revestido com poli-L-lisina. </li><li> Colocar as cápsulas contendo lamela em um 37 ° C, 5% de CO2. As lamelas revestidas devem ser incubadas durante pelo menos 24 h antes do neurónio cultura. Isto é feito para preparar o meio para neurônio cultura. </li></ol></li></ol> 4. Dissecção do hipocampo e chapeamento Neurônios <ol><li> Obter uma rata grávida (dia embrionário 18-19, tal como medido a partir do dia da descoberta rolhão vaginal) e eutanásia por decapitação anestesiados com isoflurano ou outro método aprovado. </li><li> Pulveriza-se a parte de baixo do rato com etanol a 70%, e, em seguida, fazer uma incisão da região púbica throurg para a extremidade da cavidade abdominal. Para evitar a contaminação, tomar cuidado para cortar apenas através da pele nesta etapa. </li><li> Enxaguar os instrumentos de dissecção novamente com etanol a 70%, e, em seguida, cortada através da parede abdominal para expor o útero. Remover os dois cornos uterinos e colocá-los em uma placa de Petri de 100 milímetros estéril. </li><li> Executar os restantes passos em uma câmara de fluxo laminar. Remover a membrana uterina em torno dos fetos. Decapitar-los e colocar as cabeças em um prato de 100 mm Petri contendo 20 ml CMF-HBSS. </li><li> Dissecar os cérebros imediatamente e colocá-los em uma placa de 60 mm de Petri contendo 2 mL de CMF-HBSS em gelo. Recolhe apenas 2-3 cérebros por placa para permitir espaço suficiente para o passo seguinte. </li><li> Sob um microscópio de dissecação deformam as meninges da linha média dos hemisférios cerebrais, e em seguida, dissecar os hipocampos e colocá-los em uma placa de 60 mm de Petri contendo 4,5 mL de CMF-HBSS. Note-se que o hipocampo pode ser distinguido como uma estru em forma de crescentetura na face medial do hemisfério cortical, e é fácil de remover, uma vez que é delimitado lateralmente por um ventrículo. </li><li> Transferir o tecido do hipocampo recolhido e CMF-HBSS para um tubo de 15 mL. Adicionar 0,5 ml de 2,5% de tripsina, e, em seguida, incuba-se a 37 ° C durante 10 min. A papaína pode ser usado em vez de tripsina porque é mais suave e pode aumentar o rendimento. </li><li> Suavemente remover a solução de tripsina por uma pipeta de Pasteur, deixando o tecido do hipocampo não perturbada na parte inferior do tubo. </li><li> Lavar cuidadosamente o tecido duas vezes com 5 mL de CMF-HBSS enquanto incubando-a a 37 ° C durante 5 min. Após a segunda lavagem, levar o volume total de, pelo menos, 5 mL através da adição de um volume suficiente de CMF-HBSS para o tecido. Se existem hipocampos de mais do que 10 filhotes, até 8 mL de CMF-HBSS pode ser adicionado. </li><li> Prepare duas variantes de pipetas polido-fogo para a dissociação de tecidos. A ponta de uma variante é do diâmetro normal da pipeta mas com arestas smoothened polido ao fogo. A outra variformiga é um com o diâmetro da ponta reduzida a metade. Resumidamente expor a ponta de uma pipeta Pasteur de vidro na diagonal a uma fonte de chama, e depois examinar as pontas das pipetas. <ol><li> Repetir este passo até que a extremidade da ponta tinha sido smoothened ou o diâmetro tiver sido reduzido. É importante para a prática de encontrar o diâmetro ideal para garantir que o tecido é dissociado para produzir células individuais, sem danificar estas células. </li></ol></li><li> Tritura-se o tecido do hipocampo pela primeira vez por cerca de 10 passagens através de uma pipeta de Pasteur de vidro normal, com borda lisa, e, em seguida, mais 5 a 10 passagens através da pipeta com o diâmetro reduzido. O objectivo é a obtenção de uma solução homogénea de células sem ou com muito poucos aglomerados de tecido. </li><li> Determinar a densidade celular utilizando um hemocitetro ou um contador de células automatizado. Tipicamente, 0,8 a 1,0 milhões de células por pup são obtidos quando hipocampos dos dois hemisférios são combinados. </li><li> Transferir um volume suficiente da suspensão de células a pratoscontendo lamelas de poli-L-lisina-revestidas em 4 mL de meio de plaqueamento para obter uma densidade de revestimento de 300.000 células por milímetro prato 60. A densidade das células pode variar de 100.000 a 500.000, dependendo da experiência destinada. </li><li> Após 3-4 h, transferir as lamelas com neurónios ligados aos pratos contendo as células gliais em meio de NBG. Isto deve ser feito de tal modo que o lado no qual foram colocadas as neurónios está voltada para baixo para a camada de células da glia. Adicionar um total de 4-5 lamelas por placa de células da glia. </li><li> Dois ou três dias após o plaqueamento, adicionar a solução de Ara-C para uma concentração final de 5 uM por prato para parar o crescimento da glia. </li><li> Alimentar as células, uma vez por semana por substituindo a 2 ml do meio velho com 2,5 mL de meio fresco em cada mamada. O meio é extra adicionado para compensar a evaporação ao longo do tempo, e apenas uma porção do meio é mudado para assegurar um condicionamento consistente do meio pelas células gliais. Estas culturas são tipicamente saudável para pelo menos um mês (A Figura 3). a sobrevivência de neurónios pode ser melhorada pela adição de APV para o meio de cultura para uma concentração final de 100 uM. APV é um antagonista do receptor de NMDA e promove a sobrevivência ao reduzir a excitotoxicidade do glutamato. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

Enquanto o método &quot;sanduíche&quot; de neurônios a cultura de foi bem descrita em outra parte 2, 11, há várias etapas ao longo do protocolo que são bastante difícil de descrever em texto sozinho, que pode levar à frustração para os investigadores que desejam adotá-lo. O método pode ser dividido em três grandes fluxos de trabalho: cultura da glia, preparação de lamela e de cultura de neurónios e de manutenção. Ca...

O cérebro está organizado em redes complexas de neurônios. A contribuição de neurónios individuais para a actividade de rede e função do cérebro pode ser estudada por alteração selectiva da sua composição molecular e perturbação das suas propriedades fisiológicas. A manipulação genética e química de neurónios individuais é sem dúvida mais fácil em neurónios cultivados do que em tecido cerebral intacto, livre de heterogeneidade celular deste último e complexidade. Os neurónios em cultura desenvolver axonal bem definida e mandris dendríticas e formar muitas ligações sinápticas uns com os outros. Enquanto neurónio cultura de animais adultos ou de outras regiões do sistema nervoso é possível, culturas do hipocampo de embriões são frequentemente preferidos devido à sua população de células piramidais definida e relativamente baixa densidade glial 1, 2. neurónios do hipocampo cultivados a baixa densidade em cultura são particularmente amenable para o estudo da localização sub-celular, o tráfico de proteína, polaridade e desenvolvimento neuronal sinapse. Os neurónios em cultura também têm sido extensivamente empregues no estudo dos processos moleculares na plasticidade sináptica 3, 4, 5, 6. Preparações de cultura Neuron de ratinhos com deleções genéticas globais que não sobrevivem após o parto têm sido especialmente útil no estudo de funções celulares e sinápticos de certos genes 7. Tal como no cérebro, os neurónios do hipocampo em cultura são dependentes do suporte trófico de células gliais. Isso complica a sua cultura, e tem levado ao desenvolvimento de vários métodos diferentes por que este apoio é fornecido. Um método vulgarmente utilizado envolve plaqueamento neurónios directamente numa monocamada de células gliais 8, ou que permitam que as células gliais de contaminantes a partir do Hipp adquiridatecido ocampal para proliferar e formar uma monocamada por baixo dos neurónios 9. Enquanto este método tem encontrado algum sucesso, a impureza da cultura neuronal resultante é desvantajoso para experiências de imagiologia. Outro método vulgarmente utilizado de neurónio cultura é deixar-fora do alimentador glial camada completamente, e em vez disso proporcionam suporte trófico sob a forma de um meio de crescimento definido 10. Aqui, descrevemos o &quot;sanduíche&quot; ou método &quot;Banker&quot; do neurônio cultura 2, 11. Este método envolve o plaqueamento os neurónios do hipocampo em lamelas de vidro, que depois são suspensas sobre uma monocamada de células gliais separados por contas de cera de parafina. Isto facilita a cultura de longo prazo de uma população homogénea de neurónios sem contaminar as células da glia, permitindo simultaneamente para suporte trófico da monocamada subjacente glia. Quando são neurónios de idade suficiente ou nível de maturidade,as lamelas dos neurónios pode ser virado para fora-do prato da glia e utilizado em imagiologia ou ensaios funcionais.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Dissection Instruments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Spring Scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5650</td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Spring Scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5605</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Forceps (#5)</td><td>Roboz</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Forceps (#PP)</td><td>Roboz</td><td>RS-4950</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tissue Preparation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin (2.5%)</td><td>Gibco</td><td>15-090-046</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Gibco</td><td>25-200-072</td><td></td></tr><tr><td>Swinnex Filter Holder, 25&amp;nbsp;mm</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0002500</td><td>Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave</td></tr><tr><td>Isoflorane</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td><td>CP0406V2</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>Grade 105 Lens Cleaning Tissue</td><td>GE Healthcare</td><td>2105-841</td><td>Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave</td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipettes with cotton filter</td><td>VWR</td><td>14672-412</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15-630-080</td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039;s Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x)</td><td>Gibco</td><td>14-185-052</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipettes</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Butane bunsen burner</td><td>Wall-Lenk Mfg. Co.</td><td>Model 65</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tissue Culture&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish (100 mm)</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish (60 mm)</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td>Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended.</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM)</td><td>Gibco</td><td>11-095-080</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>21-103-049</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25-030-081</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium</td></tr><tr><td>Culture Dish (60 mm)</td><td>Corning, Inc</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Culture Flasks (75 cm^2)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>Cytarabine (Ara-C)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3350000</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Growth Serum (BGS)</td><td>HyClone</td><td>SH3054103</td><td>Heat-inactivation is recommended before use.</td></tr><tr><td>B27 Supplement (50x)</td><td>Gibco</td><td>17-504-044</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic Vials</td><td>VWR</td><td>89094-806</td><td></td></tr><tr><td>DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Coverslip Preparation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium tetraborate decahydrate (borax)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9876-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine Hydrobromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>Histoplast Paraffin Wax</td><td>Fisher</td><td>22-900-700</td><td></td></tr><tr><td>Gravity Convection Oven</td><td>VWR</td><td>89511-404</td><td>Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol</td></tr><tr><td>Ultrasonic Bath (Sonicator)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15337400</td><td></td></tr><tr><td>Nitric Acid</td><td>Anachemia</td><td>62786-460</td><td></td></tr><tr><td>Ceramic Staining Racks</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td>Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Glaswarenfabrik Karl Hecht&amp;nbsp;GmbH</td><td>1001/18</td><td>Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Miscellaneous&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile Syringe Filters</td><td>VWR</td><td>28145-477</td><td>Used with BD syringe for filter-sterilization</td></tr><tr><td>Syringe&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>302832</td><td>Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization</td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-460-16Q</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td><td>ThermoScientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td><td>ThermoScientific</td><td>339652</td><td></td></tr></tbody></table>

low-density primary hippocampal neuron culture

A capacidade para sondar a estrutura e fisiologia das células nervosas individuais na cultura é crucial para o estudo da neurobiologia, e permite flexibilidade na manipulação genética e química de células individuais ou redes definidos. Tal facilidade de manipulação mais simples no sistema de cultura reduzida quando comparada com o tecido cerebral intacto. Enquanto existem muitos métodos para o isolamento e o crescimento destes neurónios primárias, cada uma tem as suas próprias limitações. Este protocolo descreve um método para a cultura de baixa densidade e de alta pureza de roedores neurónios do hipocampo embrionárias em lamelas de vidro, que depois são suspensas sobre uma monocamada de culas gliais. Esta &#39;cultura sanduíche&#39; permite o crescimento exclusivo de longo prazo de uma população de neurônios, permitindo simultaneamente para suporte trófico da monocamada glial subjacente. Quando são neurónios de idade suficiente ou nível de maturidade, as lamelas de neurónios pode ser virado para fora-do prato da glia e utilizado em imagiologia ou ensaios funcionais. g neuróniosrown por este método normalmente sobreviver por várias semanas e desenvolver mandris extensos, as conexões sinápticas, e propriedades de rede.

Neste método de &quot;sanduíche&quot; de cultura de células nervosas primárias, neurónios do hipocampo (Figura 3) crescem sobre uma camada de células da glia (Figura 1), separados por grânulos de parafina (Figura 2). Isto assegura que os neurónios selectivamente crescer em lamelas de vidro com a contaminação de células da glia mínima, mas receber suporte trófico adequada a partir de células da glia que crescem no prato de c...

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Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

Este artigo descreve o protocolo para a cultura de baixa densidade neurónios do hipocampo primárias que crescem em lamelas de vidro invertida sobre uma monocamada de células gliais. As camadas neuronais e gliais são separados por contas de cera de parafina. Os neurónios cultivados por este método são adequados para imagiologia óptica de alta resolução e ensaios funcionais.

Low-Density hipocampo Cultura Neuron primária

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

low-density-primary-hippocampal-neuron-culture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

20.5K visualizações.  University of Manitoba.  Este artigo descreve o protocolo para a cultura de baixa densidade neurónios do hipocampo primárias que crescem em lamelas de vidro invertida sobre uma monocamada de células gliais. As camadas neuronais e gliais são separados por contas de cera de parafina. Os neurónios cultivados por este método são adequados para imagiologia óptica de alta resolução e ensaios funcionais. 

Vídeo: Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection e Cultura Primária de Neurônios do hipocampo do rato embrionárias e Cortical

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Neurociência

Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and memory. Primary hippocampal cell culturing allows neuroscientists to examine the activity and properties of neurons at the individual cell and single synapse level. In this video, we will demonstrate how to isolate and grow primary hippocampal cells from newborn rats. The hippocampus may be isolated from each newborn animal in as short as 2 to 3 minutes, and the cultures can be maintained for up to two weeks. We will also briefly demonstrate how to use these hippocampal neurons for ratiometric calcium imaging. While this protocol describes the process for the hippocampus, with little to no modification, it can be applied to other regions of the brain.

The dissection and growth of cells from an individual brain area facilitates investigation of cellular and physiological parameters. We describe a method for primary cell culturing that produces neuron-enriched cultures in a serum-free environment.

Cultura primária de neurônios do hipocampo de ratos recém-nascidos P0

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and ...

Biologia

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Isolamento e Cultura de neurônios do hipocampo de ratos pré-natal

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Sex Stratified Neuronal Cultures to Study Ischemic Cell Death Pathways

Sex differences in neuronal susceptibility to ischemic injury and neurodegenerative disease have long been observed, but the signaling mechanisms responsible for those differences remain unclear. Primary disassociated embryonic neuronal culture provides a simplified experimental model with which to investigate the neuronal cell signaling involved in cell death as a result of ischemia or disease; however, most neuronal cultures used in research today are mixed sex. Researchers can and do test the effects of sex steroid treatment in mixed sex neuronal cultures in models of neuronal injury and disease, but accumulating evidence suggests that the female brain responds to androgens, estrogens, and progesterone differently than the male brain. Furthermore, neonate male and female rodents respond differently to ischemic injury, with males experiencing greater injury following cerebral ischemia than females. Thus, mixed sex neuronal cultures might obscure and confound the experimental results; important information might be missed. For this reason, the Herson Lab at the University of Colorado School of Medicine routinely prepares sex-stratified primary disassociated embryonic neuronal cultures from both hippocampus and cortex. Embryos are sexed before harvesting of brain tissue and male and female tissue are disassociated separately, plated separately, and maintained separately. Using this method, the Herson Lab has demonstrated a male-specific role for the ion channel TRPM2 in ischemic cell death. In this manuscript, we share and discuss our protocol for sexing embryonic mice and preparing sex-stratified hippocampal primary disassociated neuron cultures. This method can be adapted to prepare sex-stratified cortical cultures and the method for embryo sexing can be used in conjunction with other protocols for any study in which sex is thought to be an important determinant of outcome.

Primary disassociated embryonic hippocampal neuronal cultures are useful for investigating the signaling mechanisms involved in neuron death. Sexing the embryos before the isolation and dissociation of the hippocampus allows the preparation of separate male and female cultures, which enables the researcher to identify and investigate sex-specific cell signaling.

Sex differences in neuronal susceptibility to ischemic injury and neurodegenerative disease have long been observed, but the signaling mechanisms ...

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis of primary cultures of neurons. We describe a set of procedures for: labeling newborn mice to be genotyped, rapid genotyping, and establishing low-density cultures of brain neurons from these mice. Individual mice are labeled by tattooing, which allows for long-term identification lasting into adulthood. Genotyping by the described protocol is fast and efficient, and allows for automated extraction of nucleic acid with good reliability. This is useful under circumstances where sufficient time for conventional genotyping is not available, e.g., in mice that suffer from neonatal lethality. Primary neuronal cultures are generated at low density, which enables imaging experiments at high spatial resolution. This culture method requires the preparation of glial feeder layers prior to neuronal plating. The protocol is applied in its entirety to a mouse model of the movement disorder DYT1 dystonia (&#916;E-torsinA knock-in mice), and neuronal cultures are prepared from the hippocampus, cerebral cortex and striatum of these mice. This protocol can be applied to mice with other genetic mutations, as well as to animals of other species. Furthermore, individual components of the protocol can be used for isolated sub-projects. Thus this protocol will have wide applications, not only in neuroscience but also in other fields of biological and medical sciences.

We describe procedures for labeling and genotyping newborn mice and generating primary neuronal cultures from them. The genotyping is rapid, efficient and reliable, and allows for automated nucleic-acid extraction. This is especially useful for neonatally lethal mice and their cultures that require prior completion of genotyping.

Rápido genotipagem dos animais Seguido por Estabelecer culturas primárias de neurônios do cérebro

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic hippocampal neurons can often grow successfully on glass coverslips at high density under serum-free conditions, but low density cultures typically require a supply of trophic factors by co-culturing them with a glia feeder layer, preparation of which can be time-consuming and laborious. In addition, the presence of glia may confound interpretation of results and preclude studies on neuron-specific mechanisms. Here, a simplified method is presented for ultra-low density (~2,000 neurons/cm2), long-term (&#62;3 months) primary hippocampal neuron culture that is under serum free conditions and without glia cell support. Low density neurons are grown on poly-D-lysine coated coverslips, and flipped on high density neurons grown in a 24-well plate. Instead of using paraffin dots to create a space between the two neuronal layers, the experimenters can simply etch the plastic bottom of the well, on which the high density neurons reside, to create a microspace conducive to low density neuron growth. The co-culture can be easily maintained for &#62;3 months without significant loss of low density neurons, thus facilitating the morphological and physiological study of these neurons. To illustrate this successful culture condition, data are provided to show profuse synapse formation in low density cells after prolonged culture. This co-culture system also facilitates the survival of sparse individual neurons grown in islands of poly-D-lysine substrates and thus the formation of autaptic connections.

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

Um método simplificado para Ultra-Baixa Densidade, Long-Term Primária do hipocampo Neuron Cultura

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. Imaging studies are widely used to investigate their function and plasticity in physiological and pathological conditions. Because of their size and structure, localization studies of proteins require high-resolution imaging techniques. In this protocol, we describe a procedure to study in primary neurons the co-localization of target proteins with synaptic markers at a super-resolution level using structured illumination microscopy (SIM). SIM is a patterned-light illumination technique that doubles the spatial resolution of wide-field microscopy, reaching a detail of around 100 nm. The protocol indicates the required controls and settings for robust co-localization studies and an overview of the statistical methods to analyze the imaging data properly.

This protocol shows how to employ super-resolution microscopy to study protein co-localization in primary neuronal cultures.

Imagem de super-resolução para estudar co-localização de proteínas e marcadores sinápticos em neurônios primários

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

Easy and Reproducible Low-Density Primary Culture using Frozen Stock of Embryonic Hippocampal Neurons

Neuronal culture is a valuable system for evaluating synaptic functions and drug screenings. In particular, a low-density culture of primary hippocampal neurons allows the study of individual neurons or subcellular components. We have shown subcellular protein localization within a neuron by immunocytochemistry, neuronal polarity, synaptic morphology, and its developmental change using a low-density primary hippocampal culture. Recently, ready-to-use frozen stocks of neurons have become commercially available. These frozen stocks of neurons reduce the time needed to prepare animal experiments and also contribute to the reduction of the number of animals used. Here, we introduce a reproducible low-density primary culture method using a 96-well plate. We used a commercially available frozen stock of neurons from the rat embryonic hippocampus. The neurons can be stably cultured long-term without media changes by reducing the growth of glial cells at particular timepoints. This high-throughput assay using low-density culture allows reproducible imaging-based evaluations of synaptic plasticity.

A ready-to-use frozen stock of neurons is a powerful tool for evaluating synaptic functions. Here, we introduce an easy low-density primary culture from frozen stock using a 96-well plate.

Cultura Primária de Baixa Densidade Fácil e Reprodutível usando Estoque Congelado de Neurônios Embrionários do Hipocampo

Neuronal culture is a valuable system for evaluating synaptic functions and drug screenings. In particular, a low-density culture of primary hippocampal ...

A Technique to Culture Mouse Hippocampal Neurons

Source: Yang, R., et al. <a href="https://app.jove.com/v/61411">Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments.</a> J. Vis. Exp. (2021)
The video demonstrates a method for culturing neurons from murine hippocampi. Initially, the hippocampi undergo enzymatic digestion to break down the extracellular tissue matrix. Subsequently, the digested tissue is mechanically disrupted to isolate individual neurons. Finally, these neurons are cultured on glial feeder cells.

Uma técnica para cultivar neurônios do hipocampo de camundongos

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparing glia cell feeder dishes ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuronal Culture Techniques

Primary Neuronal Culture

Generating a Low-Density Primary Neuron Culture From Frozen Embryonic Neurons

Source: Koganezawa, N. et al., <a href="https://app.jove.com/v/64872">Easy and Reproducible Low-Density Primary Culture using Frozen Stock of Embryonic Hippocampal Neurons.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2023)
This video demonstrates the method of culturing cryopreserved embryonic neurons, involving controlled thawing, dilution with a neurobasal medium, and seeding onto a poly-L-lysine-coated plate. Subsequent incubation supports the growth and maintenance of neuronal connections.

Gerando uma cultura de neurônios primários de baixa densidade a partir de neurônios embrionários congelados

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Plate coating

	Coat a 96-well ...