1. Manutenção: Culturas Observando Sob o Microscópio <ol><li> Remover uma placa de células-tronco embrionárias humanas a partir do 37 ° C incubadora e trazer para o microscópio. </li><li> Observe as colônias em baixa potência, usando uma ampliação de 2X ou 5X, para avaliar a qualidade da cultura em geral. Observe o seguinte: cor média normal, ausência de qualquer contaminação visível, tamanho da colônia em geral, qualidade e densidade, e quaisquer outras observações. </li><li> Observar as mudanças de cor médio. Devido à mudança no pH eo esgotamento de nutrientes no meio, após um período de incubação durante a noite com as células-tronco embrionárias humanas, o meio irá mudar de uma tonalidade vermelha com um &quot;canudo&quot; de cor. Se o meio aparece roxo, uma mudança de pH básicos ocorreu. Se o meio parece extremamente amarelo, o meio tem acidificado. Meio muito amarela pode ser o resultado de colônias extremamente superlotadas no bem ou contaminação. O meio deve aparecer claro em todos os momentos. Apesar de um certo nível de restos celulares no meio é normal, ele nunca deve aparecer nublado. Se um nível elevado de restos celulares é observado, a cultura não é saudável e pode estar contaminada. </li><li> Se as culturas não necessitam de manutenção ou passaging, eles podem ser levados para o gabinete de segurança biológica de ser alimentado (ver secção 2). </li><li> Se as culturas contêm mais de cerca de 10% diferenciar as colônias, as células devem ser &quot;limpos&quot; por manualmente removendo as áreas diferenciadas (ver secção 3). </li><li> Se as culturas contêm grandes colônias ou denso, ou a camada de alimentação MEF é mais do que 12 dias de idade, as células devem ser várias passagens (ver secção 4). </li></ol> 2. Alimentação Células-tronco embrionárias humanas <ol><li> Em uma cabine de segurança biológica estéril, retire a tampa da placa de cultura e aspire o meio gasto. Não permita que a ponta da pipeta para tocar em qualquer parte da placa que não seja diretamente dentro dos poços. Se houver qualquer preocupação de contaminação, a mudança para uma pipeta nova, estéril. </li><li> Usando uma pipeta de vidro estéril, adicionar a quantidade apropriada de aquecido meio de cultura de células-tronco embrionárias humanas a cada poço. Para as culturas em uma placa de 6 poços, adicionar 2,5 mL médio por poço. </li><li> Devolver a placa para a incubadora de permanecer em 37 ° C e 5% CO 2. </li></ol> 3. Diferenciação remoção de culturas de células-tronco embrionárias humanas <ol><li> Transformar 9 polegadas de vidro Pasteur pipetas em ferramentas escolher por moldagem as dicas sobre a chama controlada de um queimador de álcool. Certifique-se que a ponta da pipeta é selada para evitar a contaminação e arredondadas para evitar riscar o plástico da placa de cultura. Esterilizar as ferramentas escolher antes de usar usando a fonte de luz UV no gabinete de segurança biológica ou escolher gabinete. </li><li> Remover as áreas diferenciadas. Diferenciação ocorre muitas vezes em apenas uma parte de uma colônia de células-tronco embrionárias humanas, geralmente ao longo das bordas ou como pontos isolados no centro. Se apenas uma seção de uma colônia é a diferenciação, apenas a área diferenciada precisa ser removido. Diferenciação pode muitas vezes levantar a placa em uma folha de &quot;pegajoso&quot;, e é útil para primeiro separar as células diferenciadas do resto da colônia desenhando uma linha através da colônia com o fim da ferramenta de colheita. </li><li> Uma vez que as peças da colônia são separados, suavemente deslizar a ferramenta escolhendo ao longo da placa para retirar as células indesejáveis. Tome cuidado para não raspar muito da camada de alimentador MEF entre as colônias nesse processo. </li><li> Quando todas as células diferenciadas são removidos da placa (e flutuando no meio), o retorno da cultura para o gabinete de segurança biológica. Aspirar o meio contendo as células diferenciadas e substituir por novos meios de cultura de células-tronco embrionárias humanas. </li></ol> 4. Passaging Células-tronco embrionárias humanas A incubação da enzima <ol><li> Em uma cabine de segurança biológica estéril, retire a tampa da placa de cultura de 6 bem e aspirar o médio gasto dos poços a serem várias passagens. Não permita que a ponta da pipeta para tocar em qualquer parte da placa que não seja diretamente dentro dos poços. </li><li> Usando uma pipeta de vidro estéril, adicionar 1 mL de colagenase IV aquecido a cada poço a ser várias passagens. </li><li> Devolver a placa para a 37 ° C incubadora por 5 minutos. </li></ol> Raspagem e Pooling as células-tronco embrionárias humanas <ol start="4"><li> Após incubar as células com colagenase, observe as colônias sob o microscópio. A enzima deve causar uma mudança sutil, mas perceptível nas bordas da colônia. </li><li> No gabinete de segurança biológica, aspirar cuidadosamente a enzima de cada poço e substituir com 2,0 mL meio de cultura de células-tronco embrionárias humanas. </li><li> Dica placa de cultura um pouco para você e assumir a médio mL 2.0 no primeiro poço, com uma pipeta de vidro de 5 mL. Segurando a pipeta perpendicular ao fundo do prato, suavemente deslizar a ponta da pipeta em todo o bem, enquanto liberando lentamente o meio. </li><li> Repita a raspagem e pipettivezes ng movimento 3-4 até que todas as colônias foram retiradas do poço. Pipeta com cuidado para não romper as colônias em muito pequeno de peças. Quando as células foram removidas do primeiro poço, deixe o conteúdo no poço e começar a raspar as células fora da próxima também. </li><li> Quando todos os poços a serem várias passagens foram raspados piscina, o meio contendo as peças de cada colônia bem em um tubo estéril 15 ml cônico. </li><li> Lave os poços raspada, adicionando 1 mL de cultura de células-tronco embrionárias humanas média a cada poço. Coletar essas lavar e transferir para o tubo cônico. </li><li> Pipeta suavemente as células no tubo para quebrar os pedaços colônia até o tamanho desejado. </li><li> Centrifugar as células por 5 minutos a 200 x g. </li></ol> Chapeamento as células-tronco embrionárias humanas Célula <ol start="12"><li> Enquanto as células-tronco embrionárias humanas são na centrífuga, prepare um novo 6 bem-alimentador placa MEF. Rótulo a placa com as informações apropriadas de células-tronco embrionárias humanas: linha celular, o número de nova passagem, ea data de passagem. Aspirar o meio de MEF dos poços e adicionar 1,0 mL de PBS a cada poço. Agite suavemente o tampão ao redor dos poços e aspire a lavagem PBS. Adicione 1,5 mL de cultura de células-tronco embrionárias humanas média a cada poço e colocou o prato de lado. </li><li> Quando as células-tronco embrionárias humanas terminar a centrifugação, o tubo de trazer de volta para o gabinete de segurança biológica. Aspirar o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o frouxamente cheia de pellet celular. </li><li> Ressuspender as células do pellet com o meio suficiente para 1 mL meio de cultura de células-tronco embrionárias por também ser banhado. Quando se dividir em seis novos poços, ressuspender o sedimento em 6 de médio mL. </li><li> Suavemente e uniformemente, adicione 1 mL da suspensão de células a cada preparado poço da placa de alimentação MEF. </li><li> Coloque a placa no 37 ° C incubadora e deslize com cuidado a placa para a frente para trás, e para os lados para distribuir uniformemente as células ao longo do poço. </li><li> Permitir que as células para anexar a 37 ° C durante a noite. </li></ol> 5. Resultados representativos: Células indiferenciadas-tronco embrionárias humanas são pequenas, bem-embalado, e geralmente consistem de propagação maior, mais fora das células. Diferenciação pode ocorrer dentro de uma colônia (Figura 1A) ou entre as colônias (Figura 3B). Morhopologies diferentes pode ser visto sob baixa ampliação sob o microscópio. A morfologia das células boas, como visto na Figura 2A, contém pequenas células hermeticamente embalados, que crescem em uma monocamada. Células devem ter limpo, bordas definidas, com pouca ou nenhuma diferenciação. As células mostrado na Figura 2B estão prontos para passaging, e as células mostrado na Figura 2C estão superlotadas. <img src="/files/ftp_upload/1427/1427fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Diferenciação em culturas-tronco embrionárias humanas. (A) a diferenciação de uma colônia (B) diferenciação entre colônias. <img src="/files/ftp_upload/1427/1427fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Morfologias visto nas culturas tronco embrionárias humanas. (A) a morfologia das células bom (B) células-tronco embrionárias humanas que estão prontos para passaging (C) celas superlotadas.

<ol>
	<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , (2005).</li></ol>

Esterilidade deve ser mantida em todos os momentos quando se trabalha com células-tronco embrionárias humanas. Limpar e esterilizar o gabinete de segurança biológica e todos os equipamentos antes do uso. Todos os reagentes devem ser filtrados utilizando um filtro de 0,22 mM tamanho dos poros antes de usar. O uso de antiboiotics em cultura de células-tronco embrionárias humanas não é necessária e deve ser evitado. Um ambiente separado deve ser configurado como uma estação de colheita designado. O invólucro estéril para a estação pode ser um gabinete estático (como uma estação de trabalho PCR) com uma fonte de luz UV, uma capela de fluxo laminar, ou uma câmara de segurança biológica. Um microscópio de dissecação dentro da estação de colheita é necessária para observar as colônias como áreas diferenciadas são removidos. O painel de vidro frontal de um gabinete estático ou um gabinete de segurança biológica deve ser modificado para permitir o oculares do microscópio para estender através do painel, sem comprometer a ventilação adequada e esterilidade. Para manter a cultura de células-tronco embrionárias humanas saudáveis, as células devem ser várias passagens no momento ideal, geralmente a cada 4-7 dias. Neste momento as colônias atingiram o seu tamanho máximo e pode estar começando a se fundir. Colônias fundiu pode aumentar a taxa de diferenciação na cultura. Relações dividido geralmente caem 1:03 - 01:05, dependendo do número de colônias banhado, a taxa de expansão, e as condições de cultura. Colônias Overplated (razão de separação muito baixo) provavelmente fundir prematuramente e precisam ser várias passagens antes que eles atinjam seu tamanho máximo. Culturas em uma camada de alimentação MEF que é mais de 2 semanas de idade deve ser várias passagens sobre a nova MEFs que irá apoiar o crescimento e proliferação indiferenciada. Uma vez que a diferenciação ocorre naturalmente em culturas de células-tronco embrionárias humanas, uma pequena quantidade é esperada. Diferenciação freqüente ou excessivo pode ocorrer se as culturas não recebem os cuidados adequados. As células devem ser alimentados todos os dias, overgrowth entre as passagens devem ser evitados. Sempre usar reagentes frescos. Todos os, meios de comunicação MEFs e reagentes deve ser usado dentro de 14 dias para evitar o crescimento de células-tronco embrionárias indiferenciadas. Novos lotes de reagentes, tais como a substituição Knockout Serum, FBS e MEFs, deve ser rastreada antes de usar. Lembre-se que as células diferenciadas não removidos antes da passaging serão transferidos para as novas culturas. Além disso, tente manter as células a 37 ° C, sempre que possível. Minimizar o tempo de as células passam fora da incubadora (por exemplo, no palco microscópio ou no gabinete de segurança biológica.) Um estágio do microscópio aquecida pode ser muito benéfico se as células serão da incubadora por longos períodos de tempo. Ao observar a culturas de células-tronco embrionárias sob o microscópio, primeiro avaliar a qualidade geral eo tamanho das colônias vista usando uma potência baixa (2x ou 5x) objetiva. Se as células potencialmente diferenciados são observados em baixa potência, confirme a morfologia diferenciadas com um objetivo maior ampliação (10X). Imediatamente após a remoção de diferenciação, as bordas das colônias poderão aparecer irregulares ou danificadas. Incubar as colônias durante a noite em meio fresco para permitir que as células restantes indiferenciadas para se recuperar. Sem a influência de diferenciação na cultura, estas colônias restantes continuarão a proliferar normalmente. Se possível, começar os experimentos com células-tronco embrionárias humanas passagem de baixo. Cariótipo das células antes e depois de todos os experimentos principais.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>D-MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11965-092</td>
<td>For MEF medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Certified</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000-044</td>
<td>Heat-inactivated 
For MEF medium</td>
</tr>
<tr>
<td>D-MEM/F-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11330-057</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Knockout&trade; Serum Replacement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10828-028</td>
<td>Pre-screen to ensure support of hES cells</td>
</tr>
<tr>
<td>bFGF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stemgent</td>
<td>03-0002</td>
<td>Use at [4 ng/mL] final</td>
</tr>
<tr>
<td>Non-essential Amino Acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11140-050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-081</td>
<td>200 mM (100X) 
Use at [1X] final
</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190-250</td>
<td>Without Ca2+ or Mg2+</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagenase IV</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17104-019</td>
<td>Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12</td>
</tr>
<tr>
<td>Gelatin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G1890</td>
<td>Type A, Porcine</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Defined</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HyClone</td>
<td>SH300.70.01</td>
<td>For freezing medium</td>
</tr>
<tr>
<td>6-well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>140675</td>
<td>For general culture</td>
</tr>
<tr>
<td>4-well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>176740</td>
<td>For thawing</td>
</tr>
<tr>
<td>5 mL glass pipets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>13-678-27E</td>
<td>Individually wrapped</td>
</tr>
<tr>
<td>15 mL conical tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430052</td>
<td>Polypropylene</td>
</tr>
<tr>
<td>Pasteur pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>13-678-20D</td>
<td>9&#x201D; glass</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

culture and maintenance of human embryonic stem cells  

Estaminais embrionárias humanas (CTeh) devem ser monitorados e tratados a fim de manter saudável, culturas indiferenciada. No mínimo, as culturas devem ser alimentados todos os dias, realizando uma mudança meio completo para repor os nutrientes perdidos e para manter as culturas livres de factores de diferenciação indesejados. Embora uma pequena quantidade de diferenciação é normal e esperado em culturas de células-tronco, a cultura deve ser rotineiramente limpos por remoção manual, ou &quot;pegar&quot; áreas diferenciadas. Identificação e remoção de excesso de diferenciação de culturas de células-tronco embrionárias humanas são técnicas essenciais para a manutenção de uma população saudável de células.

Watch this Scientific Journal Video about Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

Este protocolo demonstra como manter saudável, indiferenciada-tronco embrionárias humanas (ES) células.

Cultura e Manutenção de células estaminais embrionárias humanas

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

culture-and-maintenance-of-human-embryonic-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

47.5K visualizações.  Stemgent. Este protocolo demonstra como manter saudável, indiferenciada-tronco embrionárias humanas (ES) células.

Vídeo: Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Propagação de-tronco embrionárias humanas (ES) Células

Biologia

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Derivação de células estaminais embrionárias humanas por Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and programmed cell death. Mitochondria produce ATP, regulate the cytoplasmic redox state and Ca2+ balance, catabolize fatty acids, synthesize heme, nucleotides, steroid hormones, amino acids, and help assemble iron-sulfur clusters in proteins. Mitochondria also have an essential role in heat production. Mutations of the mitochondrial genome cause several types of human disorder. The accumulation of mtDNA mutations correlates with aging and is suspected to have an important role in the development of cancer. Due to their vitally important role in all cell types, the function of mitochondria must also be critical for stem cells. Key advances have been made in our understanding of stem cell viability, proliferation, and differentiation capacity. But the functional activity of stem cells, in particular their energy status, was not yet been studied in detail. Almost nothing is known about the mitochondrial properties of human embryonic stem cells (hESCs) and their differentiated precursor progeny. One way to understand and evaluate the role of mitochondria in hESC function and developmental potential is to directly measure the activity of mitochondrial respiratory complexes. Here, we describe high resolution clear native gel electrophoresis and subsequent in gel activity visualization as a method for analyzing the five respiratory chain complexes of hESCs.

In this video, we will show you how the mitochondrial respiratory chain complexes of human embryonic stem cells can be analyzed using in gel activity assays.

Sondagem para a Atividade Complexo mitocondrial em células estaminais embrionárias humanas

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Cromatina imunoprecipitação de células estaminais embrionárias humanas

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

Na rotulagem in vitro de células estaminais embrionárias humanas para Ressonância Magnética

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture conditions they become prone to acquire chromosomal anomalies such as addition of whole or parts of chromosomes. Indeed, during long-term culture, karyotypic alterations are observed when enzymatic or chemical dissociation are used 2,3,4, while manual dissection of colonies for passaging retains a stable karyotype 5. Besides, changes in the environment such as the removal of feeder cells also seem to compromise the genetic integrity of hESC 3,6. Once chromosomal alterations could affect cellular physiology, the characterization of the genetic integrity of hESC in vitro is crucial considering hESC as an essential tool in embryogenesis studies and drug testing. Furthermore, for future therapeutic purposes chromosomal changes are a real concern as it is frequently associated to carcinogenesis.
Here we show a simple and useful method to obtain high quality chromosome spreads for subsequent analysis of chromosome set by G-banding, FISH, SKY or CGH techniques 7,8. We recommend checking the chromosomal status routinely with intervals of 5 passages in order to monitor the appearance of translocations and aneuploidies
Priscila Britto and Rafaela Sartore contributed equally to the paper.

Karyotyping is a simple and useful technique widely used for detecting genetic alterations. Here we describe a step by step protocol for chromosome spread preparation of human embryonic stem cells for monitoring the chromosomal status of these cells maintained in culture.

Preparação Spread cromossômica de células estaminais embrionárias humanas para Cariotipagem

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Congelamento e descongelamento, células estaminais embrionárias humanas

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Diferenciação de células-tronco embrionárias em precursores oligodendroglial

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Mapeamento de destino de células estaminais embrionárias humanas por formação de teratomas

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

Adultas e embrionárias Cultura Microexplant Músculo Esquelético e isolamento de células-tronco musculares

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...