Quiescência do ciclo celular é uma característica fundamental das células-tronco hematopoiéticas. Este protocolo ajuda a entender o comportamento de HSCs humanos quiescentes in vitro em condições quase fisiológicas. Usando este protocolo, os pesquisadores podem testar o efeito de vários compostos, nutrientes ou proteínas que regulam o status do ciclo celular, bem como a diferenciação dos HSCs de forma escalável sem o uso de modelos animais.
As drogas anticâncgenas têm efeitos variados na sobrevivência de HSCs quiescentes e progenitores ciclísticos. Este protocolo permite encontrar agentes que poupem HSCs quiescentes ou agentes que danifiquem seletivamente células-tronco quiescentes. Demonstrando o procedimento estará Hiroshi Kobayashi, pesquisador sênior do Laboratório Takubo.
Para começar, dissolva 16 miligramas por palmitato de sódio mililitro, 30 miligramas por oleato de sódio mililitro, e quatro miligramas por colesterol mililitro em metanol em tubos de vidro. Armazene as soluções lipídicas a 30 graus Celsius negativos e descongele-as antes do uso. Em um tubo de vidro fresco, misture as soluções lipídicas para obter a concentração final de 100 microgramas por palmitato mililitro, 100 microgramas por oleato mililitro e 20 microgramas por colesterol mililitro.
Evaporar o metanol passando gás nitrogênio através da solução lipídica. Evapora completamente o metanol restante aquecendo o tubo de vidro em um banho de água a 37 graus Celsius. Prepare o meio DMEM/F-12 com HEPES e glutamina.
Adicione sulfato de penicilina e estreptomicina para uma concentração final de 50 unidades e 50 microgramas por mililitro, respectivamente. O médio pode ser armazenado a quatro graus Celsius por pelo menos dois meses. Adicione 4% de BSA ao meio DMEM/F-12 com HEPES e glutamina, em seguida, ajuste o pH do médio para 7,6 usando solução de hidróxido de sódio.
Adicione o meio ao tubo de vidro com os lipídios. Dissolva completamente os lipídios por sônica. Se o meio estiver opaco após a sônica, estenda o tempo de sonicação.
Quando o BSA e os lipídios são dissolvidos, as amostras devem ser armazenadas a 80 graus Celsius negativos e usadas dentro de dois meses. Adicione 0,001X de insulina, transferrina, selenita de sódio e mistura de amina de etanol ao DMEM/F-12 e depois filtre o meio misto usando um filtro de 0,22 micrômetro. Antes do uso, adicione o fator célula-tronco humana ou SCF e trombopoietina humana ou TPO à mídia cultural em uma concentração final de três nanogramas por mililitro cada.
Transfira 200 microliters dos meios de cultura previamente preparados com citocinas para placas de fundo plano de 96 poços. Para evitar a evaporação do meio, encha todos os poços nãousados com 100 a 200 microliters de PBS. Resuspend as células-tronco hematopoiéticas classificadas ou HSCs em mídia cultural sem citocinas a 60 células por microliter.
Alíquota de 600 células em cada poço. Menos de 300 células levarão a maior variação técnica e a cultura de mais de 1.000 células em um único poço deve ser evitada devido à privação de nutrientes ou acúmulo de citocinas desfavoráveis ou quimiocinas. Cultue as células em uma incubadora multi-gás umidificada a 37 graus Celsius em uma atmosfera de 5% de dióxido de carbono e 1% de oxigênio.
Após sete dias de cultivo dos HSCs purificados, até 80% das células exibiram fenótipos negativos cd34 e CD38 negativos. O número total de células dependia da concentração de citocinas. Maiores concentrações de SCF e TPO induziram a entrada no ciclo celular, proliferação e diferenciação.
O número de HSCs fenotípicos caracterizados pelo marcador CD34 positivo, CD38 negativo, CD90 positivo e CD45 RA fenotipos negativos aumentou em proporção às concentrações de SCF ou TPO, enquanto a frequência entre as células totais diminuiu. Após três meses de transplante de HSCs de medula óssea adulta cultivada, a reconstituição pode ser avaliada em função de sua frequência no sangue periférico do cd45 positivo do CD45, células negativas do CD45 Ter119 negativos. Três linhagens, incluindo células B positivas de CD19, células mielóides cd33 positivas e células T positivas CD3 foram reconstituídas em camundongos NOG transplantados com HSCs recém-descongelados ou cultivados.
Seguindo a cultura, os HSCs podem ser submetidos a perfis de expressão genética, como pcr em tempo real e sequenciamento de RNA. A validação funcional usando transplante em camundongos deficientes imunológicos também pode ser realizada. Os pesquisadores podem comparar diretamente o ciclismo e os HSCs quiescentes em condições definidas, ajustando as concentrações de citocinas.
Isso ajudará a entender os programas de auto-renovação específicos do HSC, mecanismos de resistência ao estresse e propriedades metabólicas, que são difíceis de testar as configurações in vivo.
