Gostaríamos de agradecer à Fundação Canadense para Inovação, a British Columbia Knowledge Development Fund, British Columbia Genoma ea British Columbia Ministério de Florestas e Faixa para apoiar estudos em andamento de produtividade do solo da floresta. SL foi apoiado por uma bolsa da Fundação Centro TULA financiado pela Diversidade Microbiana e Evolution.

Parte I: Extração de DNA Procedimento 1. 8 horas são necessárias, para o processamento de 6 amostras excluindo quantificação de DNA. Antes de iniciar a extração, você vai precisar de pré-chill morteiro pilão, e espátula em um freezer -20 ° C ou usando nitrogênio líquido. Além disso, pré-chill tubos de 50 ml contendo 20 ml de clorofórmio álcool isoamílico (24:1) no gelo. Definir o forno de hibridação a 65 ° C para pré-aquecer. Verifique solução CTAB, se é cristalizado quente a 60 ° C para derreter os cristais. Completar a solução de desnaturação e tampão de extração, adicionando os ingredientes passada, pouco antes de começar a extração (veja a receita abaixo). Realizar todos os procedimentos de extração em uma capela. 2. Preparar o tampão de desnaturação e tampão de extração. Nota: Para maximizar o rendimento de DNA, é fundamental para fazer precisamente buffers seguir as instruções. 3. Colocar 2 g de solo em uma argamassa pré-refrigeradas. Nota: O solo coletados em campo devem ser congeladas em gelo seco para o transporte e armazenadas a -80 ° C. Descongelar e solo peneira com uma peneira de 2 mm antes da extração do DNA. Você pode aumentar o montante inicial do solo até 10 g. 4. Adicionar 1 ml de solução de desnaturação ao solo. 5. Congelamento e moer o solo em N 2 líquido usando um pilão até que as partículas do solo olhar em pó e homogênea. Repita congelamento e trituração duas vezes. Nota: Mantenha a amostra de solo congelado durante a moagem, utilizando nitrogênio líquido suficiente para cobrir totalmente a amostra de solo. Derretendo ligeira durante a moagem é aceitável. 6. Transferir o solo de terra para um tubo de 50 ml com uma espátula de pré-refrigerados. Nota: A amostra de solo solo podem ser armazenadas a -80 ° C neste momento, se necessário. 7. Adicionar 9 ml de tampão de extração. Para misturar a solução e no solo, brevemente vortex em baixa velocidade. Nota: Para garantir o buffer é homogênea, aquecê-lo a 60 ° C por 10-15 minutos antes de usar. Manter o resto de tampão a 60 ° C em toda a extração. Vortex em velocidade 8 (numa escala onde 10 é o máximo). 8. Incubar por 40 min a 65 ° C em um forno de hibridização. Durante a incubação, os tubos de girar continuamente na velocidade mais baixa, ou inverter cuidadosamente os tubos a cada 10 minutos. Nota: Coloque o tubo horizontalmente em um forno de hibridização para permitir buffer de entrar em contato com o solo sobre uma grande superfície. A solução pode parecer um pouco viscoso durante a incubação. 9. Centrifugar a 1800 x g, por 10 min a 10-14 ° C. Transfira o sobrenadante para a pré-refrigerados tubo de 50 ml contendo 20 ml de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1), manter no gelo. Nota: Quando você transferir o sobrenadante, tome cuidado para não perturbar a camada orgânica (camada inferior). Deixe 1-2 ml de sobrenadante, se for necessário, a fim de coletar somente o sobrenadante limpo. Muitas vezes você pode ver uma camada de bege (mm aproximadamente 1-3 de espessura) em cima do sobrenadante. Não perturbe essa camada ao coletar o sobrenadante. Tente deslizar a ponta ao longo da parede do tubo para impedir a ruptura desta camada bege. Se o sobrenadante é muito turvo, repetir a extração de álcool clorofórmio-isoamílico mais uma vez no sobrenadante. Não use pipetas plásticas descartáveis ​​ao transferir clorofórmio, como clorofórmio irá derreter o plástico. Use uma pipeta de vidro, ou um copo cilindro graduado, ou derramar clorofórmio diretamente em tubos cônicos de 50 ml. 10. Extraia o pelotas do solo mais 2 vezes; 10.1. Adicionar 5 ml tampão de extração para as pelotas do solo, misture delicadamente com 1 ml ponta seguido por vórtex breve em baixa velocidade. Nota: Agite e misture o buffer antes de usar. 10.2. Incubar a 65 ° C por 10 min em forno de hibridização. Centrifugar a 1800 x g, por 10 min a 10-14 ° C. Transfira o sobrenadante para o tubo no passo 9. Manter o tubo com sobrenadante coletado e clorofórmio-álcool isoamílico em gelo durante a extração. Nota: Certifique-se de adicionar o sobrenadante para o tubo mesmo sem cruzar a mistura entre as amostras. 10.3. Repita 9.1 e 9.2 mais uma vez. 11. Usando uma placa rotativa, muito suavemente balance o tubo que contém o sobrenadante (14-19 ml) e clorofórmio-álcool isoamílico em 1,25 rpm por 10 min. Nota: Feche a tampa com muito rigor para evitar fugas. Coloque uma toalha de papel sobre a placa de balanço antes de colocar o tubo de modo que qualquer vazamento pode ser facilmente detectado. 12. Centrifugar a 1800 x g, por 20 min a 10-14 ° C. 13. Transferência de fase aquosa para um novo tubo. Nota: Não perturbar a interfase entre a fase aquosa (camada superior) e camada orgânica (inferiorcamada) quando você transferir o sobrenadante. Deixe aproximadamente 1,5-2 ml sobrenadante para garantir a coleta de apenas sobrenadante limpo. 14. Recuperar o DNA usando álcool isopropílico (15.a etapa - 21.a). Alternativamente, use Amicon ® Ultra-15 Centrífuga Dispositivos Filter (passo 15.b - 21.b) se você esperar muito baixa quantidade de biomassa em sua amostra, que irá produzir pellet dificilmente visível por isopropílico precipitação de álcool que é difícil de recuperar. 15.a. Coloque o sobrenadante para um tubo de ultracentrífuga novo. 16.a. Adicionar álcool isopropílico para o sobrenadante coletado em uma relação de volume de 0.6:1. Inverter os tubos suavemente algumas vezes para misturar. 17.a Incubar durante 30 min à temperatura ambiente. 18.a. Centrifugar a 16.000 x g, por 20 min a 20-25 ° C. Garantir os pesos de todos os tubos são equilibradas bem antes da etapa de centrifugação. Nota: Mark a direção da força centrífuga sobre o tubo, para que você possa detectar o pellet de DNA com mais facilidade quando o rendimento de DNA é baixa. 19.a. Remover álcool isopropílico por decantação ou aspiração a vácuo. Tenha cuidado para não perturbar o pellet de DNA. Nota: Remover álcool isopropílico, logo que a centrifugação seja concluída. Tenha muito cuidado para não perder o pellet de DNA. O tamanho do pellet de DNA pode variar muito, dependendo do tipo de solo, a partir de uma bem visível (~ 9 mm de diâmetro) para apenas visível. É recomendado para remover os resíduos de álcool isopropílico por aspiração ao longo da parede do tubo com cuidado para não sugar o pellet de DNA. 20.a. Seca DNA pellet em temperatura ambiente por 5-20 min. Nota: Não mais seco pellet de DNA, caso contrário, será difícil para dissolver o DNA. 21.A. Ressuspender o sedimento de DNA em 200 mL de TE. Misturá-lo tocando suave. Transferir a solução de DNA em tubo de 1,5 ml. Manter o tubo a 4 ° C durante a noite, a fim de dissolver completamente DNA. Nota: Dependendo do tamanho do pellet, você pode ajustar o volume de TE para adicionar. Geralmente 200-400 mL de TE funciona bem. * Como alternativa, siga os passos 15.b - 21.b. 15.b. Uma pré-lavagem Amicon ® Ultra-15 Centrífuga dispositivos de filtro, adicione 15 ml TE para o dispositivo e centrifugar a 3500 x g, por 10 min. Descartar o escoamento. 16.b. Coloque a solução de DNA a partir do passo 13 para o filtro Amicon pré-lavados. Centrifugar a 3500 x g até que o volume de DNA é reduzida a 200-500 mL. Descartar o escoamento. 17.b. Lavar o DNA com TE duas vezes; adicionar 10 ml TE aos dispositivos Amicon filtro. Centrifugar a 3500 x g até que o volume de DNA é reduzida a cerca de 200 mL. Descartar o escoamento. Repita mais uma vez. 18-B Transferir a solução de DNA no filtro para um tubo ml novo 1.5. 19.b. Adicionar 40 mL de TE o filtro Amicon. Lavar ambos os lados da membrana do filtro por pipetagem cima e para baixo a fim de recuperar qualquer resíduo de DNA no filtro. Adicionar esta solução de lavagem para o tubo de 18-B passo 20.b. Se necessário, o DNA pode ser ainda mais concentrada por microcontrolador Ultracel YM-30 ® Unidade Centrífuga Filter; pré-lavagem do filtro, adicionando 200 mL de TE e centrifugação a 10.000 x g por 7 minutos. Adicionar a solução de DNA para o filtro e centrifugar a 5000 x g por 1 min. Repetir a centrifugação até que a quantidade de solução de DNA no filtro reduzido a cerca de 50 ul. Nota: Máximo volume da amostra inicial para microcontrolador filtro é de 500 mL. Não centrifugue a velocidades superiores a 14.000 x g. Não mais de centrífuga até a membrana seca completamente. Garantir que algum líquido ainda cobre o filtro após a centrifugação. Se mais de centrifugado e da membrana está seca, em seguida, adicione 15 mL TE, agitar suavemente durante 30 segundos e avance para o passo 21.b. 21.b. Coloque a unidade de filtro de cabeça para baixo em um tubo novo microcontrolador e centrifugar a 1000 xg por 3 min para recuperar o DNA. 22. Quantificar DNA por TAE gel (0,8%, 0.5xTAE, 50 V por 4 horas), e por espectrofotômetro Nanodrop ou Pico-verde ensaio e leitor de placas. Nota: quantidade de DNA pode ser estimado através da comparação da faixa de amostra para a banda marcador com concentração conhecida (marcador molecular de DNA de alta ou λHindIII) sobre o gel. 23. Verificar a integridade do DNA de alto peso molecular por eletroforese em gel em campo pulsado (PFGE) com 1%, 1xTAE gel (Para mais detalhes veja o Passo II, part2 em <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?id=1387">https://www.jove.com/index/details.stp?id = 1387</a> , doi: 10.3791/1387 por Taupp et al 2009).. Nota: Você pode usar gel agarose regulares para essa finalidade QC, em vez de baixa temperatura de fusão agarose. Em resumo, as condições de eletroforese são as seguintes: 02/0250 kb, 6 volts, tempo de comutação inicial: 5 segundos, tempo final de comutação: 15 seg, executado por 12 horas a 14 ° C. Ouro SYBR coloração de uma hora para visualizar o DNA do gel. 24. Se os pesos moleculares de DNA extraídos são satisfatórios, em seguida, avance para a etapa de centrifugação de gradiente de CsCl seguinte. Alternativamente, o DNA pode ser armazenado a -20 ° C ou -80 ° C antes da centrifugação CsCl. A mediana do tamanho do DNA deve ser igual ou superior a 36 Kb, se você quiser construir uma grande biblioteca de inserir DNA metagenomic. Parte II. Purificação de DNA usando cloreto de césio ultracentrifugação de gradiente Preparação de centrifugação: 1,5 - 2 horas Etapa de centrifugação: 18 horas Removendo brometo de etídio (EtBr) e concentrando o ADN após a centrifugação: 3 horas Procedimento Para detalhes, consulte Wright et al. . 2009 <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352">https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352</a> , doi: 10.3791/1352 Resultados representante / Resultado A quantidade total de DNA genômico isolado de 2 g de floresta orgânica do solo (horizonte O) e horizontes minerais (Ae, AB, Bt e horizontes) (amostragem da produtividade do solo de Longo Prazo (LTSP) site localizado na Skulow lago, BC, Canadá e gerido pela BC Ministério de Florestas e Range) variou de 10 mg a 180 mg. O tamanho médio de DNA isolado foi geralmente entre 40-60 kb (Figura 1). A relação de absorvância a 260 nm foi nm/280 entre 1,3-1,6 e houve um pico em 230 nm, o que pode indicar a contaminação ácidos húmicos freqüentemente observada em amostras de solo. A centrifugação em gradiente de CsCl reduziu drasticamente essa contaminação e também aumentou a proporção de 260/280 para 1,8-1,9, como mostrado na Figura 2a e 2b. <img src="/files/ftp_upload/1569/1569fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Imagens figura 1. PFGE do DNA genômico extraído antes ultracentrifugação CsCl. lane1: 1 kb marcador 100 ng, pista 2: λHind III marcador 100 ng, pista 3: λHind III marcador 250 ng, pista 4: λHind III marcador 500 ng, lane5: Fosmid 36 kb marcador 100 ng, pista 6 e 7: genômica DNA isolado do solo de horizonte mineral Ae, pista 8 e 9: o DNA genômico isolado do horizonte AB mineral do solo no local LTSP localizado Skulow lago, BC <img src="/files/ftp_upload/1569/1569fig2tmb.jpg" alt="Figura 2" border="0" /> Figura 2. Chromograms do DNA genômico detectada pelo espectrofotômetro antes (A) e depois de CsCl ultracentrifugação (B). Observe a redução do valor de absorbância no comprimento de onda nm após 230 CsCl ultracentrifugação, o que indica melhoria na qualidade do DNA genômico. Por favor, <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/1569/1569fig2.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 2.

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	<li>Hurt, R. A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y., Palumbo, A. V., Tiedje, J. M., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+recovery+of+RNA+and+DNA+from+soils+and+sediments.">Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments.</a> AEM. 67 (10), 4495-4503 (2001).</li><li>Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extraction+from+0.22+&#956;M+Sterivex+filters+and+cesium+chloride+density+gradient+centrifugation.">DNA extraction from 0.22 &#956;M Sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation.</a> JoVE. , (2009).</li><li>Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+insert+environmental+genomic+library+production.">Large insert environmental genomic library production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li></ol>

Receita * Desnaturação solução 4 M isotiocianato de guanidina 10 mM Tris-HCl (pH 7,0) 1 mM EDTA 0,5% 2-mercaptoetanol <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;"><tr><td colspan="2"> Solução de desnaturação: 10 ml no total </td></tr><tr><td> Isotiocianato de guanidina (MW 118,16) </td><td> 4,73 g </td></tr><tr><td> 1M Tris-HCl (pH 7,0) </td><td> 100 l </td></tr><tr><td> EDTA 0.5M </td><td> 20 l </td></tr><tr><td colspan="2"> Adicionar água a 9,95 ml no total. </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave. </td></tr><tr><td colspan="2"> Adicionar 50 ul 2-mercaptoetanol imediatamente antes da utilização. (5 mL de 2-mercaptoetanol por 1 ml da solução de desnaturação) Nota: Manter a solução de desnaturação a 4 ° C. Não use tampão mais de uma semana. Se possível, faça uma solução tampão nova de usar. </td></tr></table> ** Tampão de extração 100 mM tampão fosfato de sódio [pH 7,0] 100 mM Tris-HCl [pH 7,0] 100 mM EDTA [pH 8,0] 1,5 M NaCl Brometo de hexadeciltrimetilamônio 1% (CTAB) 2% SDS <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;"><tr><td colspan="2"> Tampão de extração de 1 L, no total </td></tr><tr><td> Sódio 1M tampão fosfato [pH 7,0] * </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> 1M Tris-HCl [pH 7,0] </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA [pH 8,0] </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 300 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave e mantê-lo à temperatura ambiente. </td></tr><tr><td colspan="2"> Adicionar 200ml, brometo de hexadeciltrimetilamônio 5% (CTAB, autoclavado) e 100 ml, 20% SDS (autoclavada) imediatamente antes da utilização. Se CTAB foi cristalizado, derretê-lo a 60 ° C. * Tampão fosfato de sódio 1M: 57,7 ml, sódio 1M fosfato monossódico (NaH 2 PO 4) e 42,3 ml, 1M Fosfato de sódio dibásico (NaH 2 PO 4). Ajustar o pH para 7,0 Nota: Não use SDS 20% se tiver precipitação. É normal ver suspensão leitosa quando você adiciona SDS para a solução. Uma vez que você adicionar SDS, coloque o tampão de extração a 60 ° C para garantir SDS é bem suspenso. </td></tr></table>

extraction of high molecular weight genomic dna from soils and sediments

O microbioma do solo é um reservatório vasto e relativamente inexplorado da diversidade genômica e inovação metabólica que está intimamente associado com nutrientes e fluxo de energia nos ecossistemas terrestres. Cultivo independente de genômica ambiental, também conhecida como metagenomic, abordagens prometem um acesso sem precedentes a essa informação genética no que diz respeito à reconstrução caminho e triagem funcional para terapêuticas de alto valor e os processos de conversão de biomassa. No entanto, o microbioma solo ainda permanece um desafio em grande parte devido à dificuldade na obtenção de DNA de alto peso molecular de qualidade suficiente para a produção de grandes inserir biblioteca. Aqui nós apresentamos um protocolo para a extração de alto peso molecular, o DNA genômico microbiana comunidade de solos e sedimentos. A qualidade do DNA genômico isolado é ideal para a construção de grandes bibliotecas genômicas inserir ambientais para aplicações a jusante seqüenciamento e análise. O procedimento começa com a lise celular. Paredes celulares e membranas de micróbios são lisadas por ambas as forças mecânicas (trituração) e químicas (β-mercaptoetanol). DNA genômico é então isolado usando tampão de extração, clorofórmio-álcool isoamílico e álcool isopropílico. Os buffers empregados para a lise e os passos de extração incluem isotiocianato de guanidina e brometo de hexadeciltrimetilamônio (CTAB) para preservar a integridade do DNA genômico de alto peso molecular. Dependendo da sua aplicação a jusante, o DNA genômico isolado pode ser purificado usando cloreto de césio (CsCl) ultracentrifugação de gradiente, o que reduz as impurezas, incluindo os ácidos húmicos. O primeiro procedimento, a extração, leva aproximadamente 8 horas, com exclusão de etapa de quantificação de DNA. A ultracentrifugação gradiente de CsCl, é um processo de dois dias. Durante todo o procedimento, o DNA genômico deve ser tratada com cuidado para evitar corte, evitar vórtex grave e dura pipetagem repetitiva.

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Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

Uma metodologia para isolar alto peso molecular e DNA genômico de alta qualidade da comunidade microbiana do solo é descrito.

Extração de DNA genômico de alto peso molecular de solos e sedimentos

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

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Research

JoVE Journal

Biology

25.5K visualizações.  University of British Columbia - UBC. Uma metodologia para isolar alto peso molecular e DNA genômico de alta qualidade da comunidade microbiana do solo é descrito.