Este estudo foi financiado em parte pelo Instituto Nacional de Saúde (GM071440 a CH e NS051630/MH076090/MH078972 para PJ).

1. A fragmentação de ADN genómico Fragmento de ADN genómico utilizando sonicação de uma gama de tamanhos desejada adequada para a plataforma de sequenciamento do genoma. (Nós normalmente sonicar a ~ 300 pb.) Verificar a distribuição do tamanho do ADN genómico fragmentado em 1% de gel de agarose (Figura 1). 2. Preparação de ADN Determinar as quantidades de ADN a partir baseadas na abundância de 5 HMC em ADN genómico. Desde 5-HMC níveis variam significativamente em diferentes tipos de tecidos, quantidades de DNA a partir dependem dos níveis de 5-HMC das amostras. Por favor, consulte a Tabela 1 para exemplos. 3. β-GT reacção catalisada (reacção de transferência de Glicose) <ol><li> Misturar por pipetagem da mistura, como detalhado na Tabela 2 e incuba-se em um banho de água a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Após a incubação, limpar-se a mistura reaccional com remoção Kit QIAquick Nucleotide, utilizando 10 jig de DNA porcoluna. Eluir com 30 ul de água por coluna e combinar. </li></ol> 4. Reação Biotinilação (Clique Química) <ol><li> Adicionar DBCO-SS-PEG3-biotina conjugado de solução de trabalho (1 mM) na solução de ADN eluído (do passo 3) para uma concentração final de 150 uM (ou seja, 5 uL de solução de trabalho por 30 ul de solução de ADN). </li><li> Misturar por pipetagem, e incubar em banho de água a 37 ° C durante 2 horas. </li><li> Limpe a reação com QIAquick Removal Kit Nucleotide. O volume de eluição total ideal é de 100 uL. </li><li> Quantificar a quantidade de DNA recuperado usando microlitro espectrofotômetro escala (por exemplo., NanoDrop). </li></ol> 5. Captura de 5 HMC contendo DNA <ol><li> Lave 50 ul de Dynabeads MyOne Estreptavidina C1 3 vezes com 1 ml de 1X tampão B &amp; W de acordo com as instruções do fabricante. Separa-se as pérolas com um suporte magnético. </li><li> Adicionar um volume igual de 2X tampão B &amp; W para o D recuperado biotiniladoNA (100 ul) às pérolas lavadas. </li><li> Incubar durante 15 min à temperatura ambiente com rotação suave num agitador rotativo. </li><li> Separa-se as pérolas com um suporte magnético e lavar as pérolas três vezes com 1 ml de 1X tampão B &amp; W. </li><li> Eluir o DNA através da incubação as pérolas em 100 ul de DTT mM preparada de fresco 50 durante 2 h à temperatura ambiente, com rotação suave num agitador rotativo. </li><li> Separa-se as pérolas com um suporte magnético. Aspirar o eluente e uma carga para Micro Bio-Spin 6 Coluna de acordo com a instrução de fabrico para remover o DTT. O ADN alvo é a solução agora. </li><li> Purifica-se o DNA eluído a partir do passo anterior, Qiagen Purification Kit MinElute PCR DNA e elui-se em 10 ul de tampão EB. Quantificar DNA usando Fluorometer Qubit ou NanoDrop se a concentração é superior a 20 ng / ul. O DNA está pronto para jusante preparação biblioteca genômica sequenciação. </li></ol> 6. Resultados representativos Se a qualidade de of DNA genómico é elevada, o rendimento de recuperação típicos após a β-GT e reacções de biotinilação são ~ 60-70%. No entanto, a eficiência da captação variar significativamente com os tipos de tecidos diferentes, dependendo dos níveis de 5-HMC das amostras. Normalmente, a eficiência da captação de DNA genómico cérebro é ~% 4-9, e, em alguns casos extremos, a eficiência pode atingir até 12%. No caso de células ES, a eficiência da captação média é de aproximadamente 2-4%, em contraste com a ~ 0,5% para as células estaminais neurais. A menor eficiência visto até agora foi para o DNA genômico de células cancerosas. Todos DNA enriquecido está pronto para o padrão da próxima geração de protocolos de preparação de bibliotecas. Além disso, o ADN capturado pode também ser usado como molde para a PCR em tempo real para detectar o enriquecimento de alguns fragmentos em comparação com o ADN de entrada, se os iniciadores relacionados estão disponíveis. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4441/4441fig1.jpg" /> Figura 1. Sonicados fragmentos genómicos humanos de DNA em1% de gel de agarose. De 10 ug de DNA genómico isolado a partir de células humanas do iPS em 120 ul de tampão TE 1X foi sonicada usando um dispositivo de ultra-sons (Covaris). Após sonicação, 2 ul do DNA sonicado foi carregada num gel de agarose a 1% utilizando 100 pb do marcador de DNA para comparar os tamanhos dos fragmentos de DNA sonicados. <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume </td><td> Concentração Final </td></tr><tr><td> Água </td><td> _ Ul </td><td></td></tr><tr><td> 10 X tampão de reacção β-GT </td><td> 2 ul </td><td> 1 X </td></tr><tr><td> Até 10 ug de ADN genómico </td><td> _ Ul </td><td> Até 500 ng / uL </td></tr><tr><td> UDP-N-6, 3-Glc (3 mM) </td><td> 0,67 ul </td><td> 100 uM </td></tr><tr><td> β-GT (40 uM) </td><td> 1 ul </td><td> 2 uM </td></tr><tr><td> Volume total </td><td> 20 ul </td&gt; <td></td></tr></tbody></table> i) Para o DNA genômico de tecidos (conteúdo 5 HMC alta&gt; 0,1%) <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume </td><td> Concentração Final </td></tr><tr><td> Água </td><td> _ Ul </td><td></td></tr><tr><td> 10 X tampão de reacção β-GT </td><td> 10 ul </td><td> 1 X </td></tr><tr><td> Até 20 ug de ADN genómico </td><td> _ Ul </td><td> Até 500 ng / uL </td></tr><tr><td> UDP-6-N3-Glc (3 mM) </td><td> Ul 1,33 </td><td> 100 uM </td></tr><tr><td> β-GT (40 uM) </td><td> 2 ul </td><td> 2 uM </td></tr><tr><td> Volume total </td><td> 40 ul </td><td></td></tr></tbody></table> ii) Para o ADN genómico de células estaminais (mediana 5 HMC conteúdo ~ 0,05%) <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume </td><td> Concentração Final </td></tr><tr><td> Água </td><td> _ Ul </td><td></td></tr><tr><td> 10 X tampão de reacção β-GT </td><td> 10 ul </td><td> 1 X </td></tr><tr><td> Até 50 ug de ADN genómico </td><td> _ Ul </td><td> Até 500 ng / uL </td></tr><tr><td> UDP-6-N3-Glc (3 mM) </td><td> 3,33 ul </td><td> 100 uM </td></tr><tr><td> β-GT (40 uM) </td><td> 5 ul </td><td> 2 uM </td></tr><tr><td> Volume total </td><td> 100 ul </td><td></td></tr></tbody></table> iii) Para o câncer de DNA genômico de células (conteúdo 5 HMC baixo ~ 0,01%) Tabela 1. Exemplos de quantidades de ADN de entrada e de reacções de etiquetagem utilizando as amostras com diferentes níveis de HMC-5 através do método selectivo química rotulagem. <table border="1"><tbody><tr><td> Amostra </td><td> 5 HMC nível </strong&gt; </td><td> ADN de partida (mg) </td><td> A recuperação após a etiquetagem (entrada de esferas) (ig) </td><td> Rendimento de recuperação </td><td> Pull-down DNA (ng) </td><td> Puxe para baixo rendimento </td></tr><tr><td> Cerebelo do rato adulto </td><td> 0,4% </td><td> 10 </td><td> 7,5 </td><td> 75% </td><td> 236 </td><td> 3,1% </td></tr><tr><td> Pós-natal do rato 7 dias cerebelo </td><td> 0,1% </td><td> 11 </td><td> 9 </td><td> 82% </td><td> 140 </td><td> 1,6% </td></tr><tr><td> Rato de células ES E14 </td><td> 0,05% </td><td> 60 </td><td> 42 </td><td> 70% </td><td> 350 </td><td> 0,8% </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Resultados representativos a partir de tecidos e células do cérebro de rato ES.

<ol>
	<li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+gene+expression:+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals.">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nat. Genet. , 245-254 (2003).</li><li>Ito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tet+proteins+in+5mC+to+5hmC+conversion,+ES-cell+self-renewal+and+inner+cell+mass+specification.">Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification.</a> Nature. 466, 1129-1133 (2010).</li><li>Tahiliani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1.">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li><li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+DNA+base+5-hydroxymethylcytosine+is+present+in+Purkinje+neurons+and+the+brain.">The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain.</a> Science. 324, 929-930 (2009).</li><li>Ko, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2.">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468, 839-843 (2010).</li><li>Koh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet1+and+tet2+regulate+5-hydroxymethylcytosine+production+and+cell+lineage+specification+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Tet1 and tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine production and cell lineage specification in mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 200-213 (2011).</li><li>Iqbal, K., Jin, S. G., Pfeifer, G. P., Szabo, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+the+paternal+genome+upon+fertilization+involves+genome-wide+oxidation+of+5-methylcytosine.">Reprogramming of the paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation of 5-methylcytosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3642-3647 (2011).</li><li>Wossidlo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylcytosine+in+the+mammalian+zygote+is+linked+with+epigenetic+reprogramming.">5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming.</a> Nat. Commun. 2, 241 (2011).</li><li>Gu, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Tet3+DNA+dioxygenase+in+epigenetic+reprogramming+by+oocytes.">The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes.</a> Nature. 477, 606-610 (2011).</li><li>Dawlaty, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet1+is+dispensable+for+maintaining+pluripotency+and+its+loss+is+compatible+with+embryonic+and+postnatal+development.">Tet1 is dispensable for maintaining pluripotency and its loss is compatible with embryonic and postnatal development.</a> Cell Stem Cell. 9, 166-175 (2011).</li><li>Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behaviour+of+5-hydroxymethylcytosine+in+bisulfite+sequencing.">The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing.</a> PLoS One. 5, e8888 (2010).</li><li>Song, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine.">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nat. Biotechnol. 29, 68-72 (2011).</li><li>Pastor, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine+in+embryonic+stem+cells.">Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells.</a> Nature. 473, 394-397 (2011).</li><li>Matarese, F., Pau, C. a. r. r. i. l. l. o. -. d. e. S. a. n. t. a., E, ., Stunnenberg, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylcytosine:+a+new+kid+on+the+epigenetic+block.">5-Hydroxymethylcytosine: a new kid on the epigenetic block.</a> Mol. Syst. Biol. 7, 562 (2011).</li><li>Szwagierczak, A., Bultmann, S., Schmidt, C. S., Spada, F., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+enzymatic+quantification+of+5-hydroxymethylcytosine+in+genomic+DNA.">Sensitive enzymatic quantification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA.</a> Nucleic Acids Res. 38, 181 (2010).</li><li>Terragni, J., Bitinaite, J., Zheng, Y., Pradhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+recombinant+&#946;-glucosyltransferase+and+analysis+of+global+5-hydroxymethylcytosine+in+unique+genomes.">Biochemical characterization of recombinant &#946;-glucosyltransferase and analysis of global 5-hydroxymethylcytosine in unique genomes.</a> Biochemistry. , (2012).</li><li>Rusmintratip, V., Sowers, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unexpectedly+high+excision+capacity+for+mispaired+5-hydroxymethyluracil+in+human+cell+extracts.">An unexpectedly high excision capacity for mispaired 5-hydroxymethyluracil in human cell extracts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14183-14187 (2000).</li><li>Globisch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine+and+search+for+active+demethylation+intermediates.">Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates.</a> PLoS One. 5, e15367 (2010).</li><li>Yildirim, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mbd3/NURD+Complex+Regulates+Expression+of+5-Hydroxymethylcytosine+Marked+Genes+in+Embryonic+Stem+Cells.">Mbd3/NURD Complex Regulates Expression of 5-Hydroxymethylcytosine Marked Genes in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 147, 1498-1510 (2011).</li><li>Szulwach, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+5-hydroxymethylcytosine+into+the+epigenomic+landscape+of+human+embryonic+stem+cells.">Integrating 5-hydroxymethylcytosine into the epigenomic landscape of human embryonic stem cells.</a> PLoS Genet. 7, e1002154 (2011).</li><li>Szulwach, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging.">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nat. Neurosci. 14, 1607-1616 (2011).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

5-hydroxymethylcytosine (5 HMC) é uma modificação do presente recentemente identificado epigenética em quantidades substanciais em certos tipos de células de mamíferos. O método aqui apresentado é para determinar a distribuição de todo o genoma de 5 HMC. Usamos bacteriófago T4 β-glicosiltransferase para transferir uma porção glucose engenharia contendo um grupo azida para o grupo hidroxilo de 5 HMC. O grupo azida pode ser quimicamente modificados com biotina para a detecção, o enriquecimento por afinidad...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Catalogo </td><td> Comentário </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagentes </td></tr><tr><td> O cloreto de sódio 5 M (NaCl) </td><td> Promega </td><td> V4221 </td><td></td></tr><tr><td> PH 8,0 0,5 M de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) </td><td> Promega </td><td> V4231 </td><td></td></tr><tr><td> 1M Trizma base (Tris) pH 7,5 </td><td> Invitrogen </td><td> 15567-027) </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 1M, pH 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de magnésio (MgCl2) 1M </td><td> Ambion </td><td> AM9530g </td><td></td></tr><tr><td> Dimetil-sulfóxido (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Fisher biorreagentes </td><td> BP337-100 </td><td></td></tr><tr><td> DBCO-SS-PEG3-biotina conjugado </td><td> Clique em Ferramentas Química </td><td> A112P3 </td><td></td></tr><tr><td> 1,4-Ditiotreitol, ultrapura (TDT) suprapuro </td><td> Invitrogen </td><td> 15508-013 </td><td></td></tr><tr><td> QIAquick Removal Kit Nucleotide </td><td> Qiagen </td><td> 28304 </td><td></td></tr><tr><td> Micro Bio-Spin 6 Coluna </td><td> Bio-Rad </td><td> 732-6222 </td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads MyOne </td><td> Invitrogen </td><td> 650-01 </td><td></td></tr><tr><td> Estreptavidina C1 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Qiagen MinElute PCR Purification Kit </td><td> Qiagen </td><td> 28004 </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 16500500 </td><td></td></tr><tr><td> UDP-6-N 3-glucose </td><td> Motivo ativa </td><td> 55013 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Enzima </td></tr><tr><td> β-glicosiltransferase (β-GT) </td><td> New England Biolab </td><td> M0357 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Dispositivo sonicação </td><td> Covaris </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Centrífuga de mesa </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Banho de água </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Aparelho de gel de corrida </td><td> Bio-Rad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop1000 </td><td> Thermo Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Labquake Tubo Shaker </td><td> Barnstead </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Labquake Tubo Shaker </td><td> Thermolyne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Suporte de Separação Magnética </td><td> Promega </td><td> Z5342 </td><td></td></tr><tr><td> Qubit 2,0 Fluorometer </td><td> Invitrogen </td><td></td&gt; <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Configuração de reagente 10 X Reacção β-GT tampão (500 mM de HEPES pH 7,9, 250 mM de MgCl 2) 2 X de ligação e de lavagem (B &amp; W) de tampão (10 mM Tris pH 7,5, EDTA 1 mM, NaCl 2 M, Tween a 0,02% 20) . </td></tr></tbody></table>

selective capture of 5-hydroxymethylcytosine from genomic dna

5-metilcitosina (5-mC) constitui ~ 2-8% das citosinas totais no DNA genómico humano e um impacto de uma ampla gama de funções biológicas, incluindo a expressão de genes, a manutenção da integridade do genoma, a impressão parental, inactivação do cromossoma X, a regulação dos desenvolvimento, envelhecimento, cancro e 1. Recentemente, na presença de um oxidado 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5 HMC), foi descoberto em células de mamíferos, em particular no estaminais embrionárias (ES) e células neuronais 2-4. 5 HMC é gerado por oxidação de 5-mC catalisada por TET família de ferro (II) / α-cetoglutarato-dependente dioxigenases 2, 3. 5 HMC é proposto para ser envolvido na manutenção de células estaminais embrionárias (MES), a hematopoiese normal e doenças malignas, e o desenvolvimento do zigoto 2, 5-10. Para melhor compreender a função da 5-HMC, um sistema de sequenciação fiável e simples é essencial. Seqüenciamento bissulfito tradicional não pode distinguir 5 HMC de 5-MC 11 </sup&gt;. Para desvendar a biologia de 5 HMC, temos desenvolvido um método químico altamente eficaz e selectivo para etiquetar e capturar 5 HMC, aproveitando-se de uma enzima de bacteriófago que adiciona uma porção de glucose a 5 HMC especificamente 12. Aqui descrevemos um procedimento em duas etapas simples para rotulagem química seletiva de 5-HMC. No passo de rotulagem em primeiro lugar, 5 HMC em ADN genómico é marcado com um catalisada 6-azida-glucose por β-GT, uma glicosiltransferase de bacteriófago T4, de uma maneira que transmite a 6-azida-glucose a 5 HMC do cofactor modificado, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). No segundo passo, biotinilação, de um ligante de biotina de dissulfureto é ligado ao grupo azida por química do clique. Ambos os passos são altamente específicos e eficiente, levando à completa marcação, independentemente da abundância de 5 HMC em regiões genómicas e dando de fundo extremamente baixos. Seguindo a biotinilação de 5 HMC, os fragmentos de 5 HMC contendo ADN são então selectivamente capturadautilizando contas de estreptavidina de um modo independente de densidade. Os fragmentos resultantes de 5 HMC enriquecidas de DNA pode ser utilizado para as análises a jusante, incluindo a última geração de sequenciação. Nossa marcação selectiva e protocolo de captura confere alta sensibilidade, aplicável a qualquer fonte de DNA genômico com variáveis ​​/ diverso 5 HMC-abundâncias. Embora o objetivo principal deste protocolo é a sua aplicação a jusante (ou seja., Sequenciamento de última geração para mapear a distribuição de 5 HMC no genoma), é compatível com molécula única, em tempo real SMRT (DNA) de seqüenciamento, que é capaz de fornecer uma única base de sequenciação de resolução de 5 HMC.

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Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Descrita é um processo de rotulagem em duas etapas usando β-glicosiltransferase (β-GT) para transferir uma azida de glucose para 5 HMC, seguido por química do clique para transferir de um ligante de biotina para o enriquecimento fácil e densidade independente. Este método de marcação eficiente e específico permite o enriquecimento de 5 HMC com fundo extremamente baixo e de alto rendimento de mapeamento epigenômico via sequenciamento de última geração.

Captura selectivo de 5-hydroxymethylcytosine a partir de DNA genómico

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

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11.9K visualizações.  Emory University School of Medicine. Descrita é um processo de rotulagem em duas etapas usando β-glicosiltransferase (β-GT) para transferir uma azida de glucose para 5 HMC, seguido por química do clique para transferir de um ligante de biotina para o enriquecimento fácil e densidade independente. Este método de marcação eficiente e específico permite o enriquecimento de 5 HMC com fundo extremamente baixo e de alto rendimento de mapeamento epigenômico via sequenciamento de última geração.