Autores gostariam de agradecer a Nancy Downer e todos os membros do laboratório de Química Analítica, Universidade de Roma &quot;Tor Vergata&quot; por sua colaboração e apoio logístico. Este trabalho foi financiado pelo projecto da União Europeia &quot;BioCop&quot;.

1) Bloqueio de esferas magnéticas revestidas: Proceder como a seguir para bloquear Revestido esferas magnéticas: <ol><li> Preparar um conjunto de 2 tubos Eppendorf ml; </li><li> Homogeneizar (balançando, mas não vórtice) revestido esferas magnéticas (veja o apêndice para a preparação de esferas magnéticas revestidas) utilizando a amostra rotativa misturador; </li><li> Imediatamente após a homogeneização, pipetar 10 ml de esferas magnéticas revestidas em cada tubos separados Eppendorf; </li><li> Adicionar 1 ml de leite desnatado solução de bloqueio em cada tubo Eppendorf do conjunto; </li><li> Deixe esferas magnéticas incubar por 30 min em temperatura ambiente no mixer amostra rotativa; </li><li> Remover solução de bloqueio: para fazê-lo colocar o tubo no concentrador de partículas magnéticas com a parte magnética colocar por 2 min (ver esferas magnéticas que adere na parede lateral do tubo); cuidadosamente pipeta fora o sobrenadante, deixando contas inalteradas; </li><li> Adicionar 1 ml de tampão PBS + NaN 3 + BSA como solução de armazenamento para cada tubo; </li><li> Loja revestido e bloqueou esferas magnéticas a 4 ° C (note que revestido esferas magnéticas são estáveis ​​por pelo menos 2 meses a 4 ° C); </li></ol> 2) cadeia imunológica em esferas magnéticas para a construção da curva de calibração e análise de amostras Proceder como a seguir a ter esferas magnéticas pronto para a medição: <ol><li> Pegue um tubo de Eppendorf (2 ml) de solução revestido e bloqueado para cada extracto de amostra que você vai analisar; </li><li> Pegue um tubo Eppendorf extra para cada solução de calibração de trabalho; </li><li> Homogeneizar as esferas magnéticas por 2 min no mixer amostra girando antes de usar; </li><li> Remover o líquido de armazenamento usando concentrador de partículas magnéticas; </li><li> Lavar as esferas magnéticas três vezes com PBS / BSA a solução de lavagem. Retirar a roupa líquido; </li><li> Passo competição: Adicionar para cada tubo contendo as contas lavados magnético, extrato de 200μl da amostra preparada, uso um tubo magnético talão para cada amostra. Repita o mesmo procedimento para cada solução padrão. Adicione 200 ml de solução de anticorpo monoclonal para cada tubo magnético talão. Deixe esferas magnéticas incubar por meia hora no misturador de rotação da amostra em temperatura ambiente; </li><li> Remover a partir de tubos Eppendorf a solução utilizada para a competição passo; </li><li> Rotulagem passo: Adicionar 400μl de anticorpo marcado secundária a cada magnética tubo Eppendorf talão. Deixe esferas magnéticas incubar por meia hora no misturador de rotação da amostra em temperatura ambiente; </li><li> Remover rotulagem solução de tubos Eppendorf; </li><li> Lavar as esferas magnéticas três vezes com PBS / Tween ® 20 solução de lavagem. Remover o líquido; </li><li> Ressuspender com 100μl de tampão DEA cada alíquota de esferas magnéticas. Agora, a esferas magnéticas estão prontos para a etapa de medição eletroquímica; </li></ol> 3) Assembléia de PalmSens ao Multiplexer (Mux) opções Por favor note: produto de hidrólise enzimática do substrato faltas a superfície do eletrodo, por esta razão um novo eletrodo é necessário para cada medição. <ol><li> Conectar um laptop PC para PalmSens através do cabo serial; </li><li> Ligue a ficha 9-DIN de CH8 Multiplexer com PalmSens. </li><li> Conecte o cabo de série dos Oito canal de contato elétrico com Mux CH8 Multiplexer; </li><li> Colocar a tira de eletrodo no bloco ímã oito. Preste atenção para colocar cada um ímã em cada eletrodos de trabalho (de nota, a necessidade de um ímã único para cada eletrodo é imperativo caso contrário, a partícula magnética não será concentrado na área do eletrodo de trabalho); </li><li> Conecte os eletrodos strip em oito canal de contato Mux elétrica; </li></ol> Para a medição DPV usar os seguintes parâmetros nas caixas apropriadas: E começar: 0 (V); fim E: 0,6 (V); passo E: 0,016 (V); E pulso: 0,0339 (V); E condicionado: 0 (V); deposição E: 0 (V); Taxa de leitura : 0,1 (V / s); T pulso: 0,06 (s); condicionado T: 0 (s); T deposição: 0 (s); equilíbrio T: 8 (s). 4) reação enzimática e Eletroquímica Medição <ol><li> Homogeneizar agitando cada tubo Eppendorf contendo esferas magnéticas pronto para etapa de medição eletroquímica, a fim de obter uma suspensão bem dispersa de esferas magnéticas; </li><li> Pipeta de cada Eppendorf, imediatamente após a homogeneização, uma alíquota de 20 mL da dispersão magnética talão para a superfície do eletrodo de trabalho correspondente. Para cada eletrodo de uma tira de usar 20 l de esferas magnéticas tomadas a partir de tubos Eppendorf diferentes (por exemplo, por oito use eletrodo oito Eppendorf diferentes); </li><li> Adicionar 80 ml de solução substrato enzimático no primeiro eletrodo. Iniciar 2 min contagem regressiva. Após 14 segundos, adicione 80 ml de solução substrato enzimático sobre o segundo eletrodo. Após mais 14 segundos, adicione 80 ml de solução substrato enzimático sobre o terceiro eletrodo. Proceder ao int mesmo tempoErval (14 segundos) até o último eletrodo (que significa: queda cada alíquota de substrato com intervalos de 14 seg). O tempo de intervalo de 14 segundos é calculado como o tempo exigido pelo potenciostato para executar a medição; de nota, a solução 80 mL em cada sensor deve cobrir o eletrodo de referência de trabalho, e contador. Além disso, as soluções para cada sensor não deve entrar em contato com soluções de eletrodos vizinhos. </li><li> Após a 2 min contagem decrescente a partir da primeira adição da solução do substrato enzimático, inicie a medição eletroquímica; </li><li> Use o PalmSens Lite software para obter picos de corrente (mA) para cada solução. </li></ol> 5 Cálculo) Estabelecer uma curva de calibração usando uma equação logística quatro parâmetros e calcular a concentração da quantidade total de toxina HT-2/T-2 em nanogramas por mililitro de cada tubo Eppendorf contendo amostra desconhecida. Os dados experimentais, a altura máxima (mA) contra a concentração dos calibradores (ng / ml), têm de estar equipados com um não-linear logístico quatro parâmetros-(4-PL) enredo equação (1) (usando Sigma Plot 8.0 ou Kaleidagraph). O modelo de 4-PL não-linear é usualmente adotado para descrever ligante ensaios de ligação (LBAs) 6. <img src="/files/ftp_upload/1588/1588eq1.jpg" alt="Equação 1" /> (1) a, b, x0, y0 são parâmetros logística como dado pelo programa Sigma Plot caber curva. Use a fórmula explicada para calcular o teor de HT-2/T-2 montante total de toxina na solução de amostra diluída extrair <img src="/files/ftp_upload/1588/1588eq2.jpg" alt="Equação 2" /> (2) x é a concentração em massa da quantidade total de HT-2/T-2 toxinas na solução extrato diluído, calculado a partir da equação 4 parâmetros logística em nanograma por milliltre (ng / ml) y é o valor atual em mA obtidos para a amostra desconhecida Apêndice 6) revestido esferas magnéticas Proceder como a seguir a ter revestido esferas magnéticas: Procedimento de lavagem <ol><li> Homogeneizar Dynabeads tosylactivated ® M-280 (solução 2 x 109 grânulos / ml) por agitação e vórtex (velocidade máxima) por 1 min (para evitar a formação de espuma) (observe a concentração de esferas magnéticas deve ser sempre o mesmo para garantir reprodutibilidade em a medição); </li><li> Imediatamente pipetar 1 ml das esferas acima homogeneizada em um tubo Eppendorf 2 ml; </li><li> Colocar o tubo no concentrador de partículas magnéticas com a parte magnética colocar por 2 min (ver esferas magnéticas furar na parede lateral do tubo); </li><li> Cuidadosamente pipeta fora do sobrenadante, deixando contas inalteradas; </li><li> Retire o tubo Eppendorf do concentrador de partículas magnéticas e ressuspender as contas em 1 ml de 0,1 M de borato pH 9,5. Misture delicadamente por 2 minutos no liquidificador amostra rotativa por 2 min; </li><li> Pipeta fora do sobrenadante; </li><li> Pipetar 1 ml de solução tampão borato no tubo Eppendorf. Esferas magnéticas está agora pronto para a etapa de revestimento; </li></ol> Procedimento de revestimento <ol start="8"><li> Adicione 600 ml de HT-2 conjugado com KLH solução-mãe (Keyhole Limpet Hemocianina) a 1 ml de esferas magnéticas) (final de concentração HT-2-KLH de 375 mg / ml); incubar esferas magnéticas e HT-2-KLH solução para 20h a 37 ° C * com rotação lenta em tilt giratório misturador amostra; </li><li> Depois de colocar o tubo de incubação no concentrador de partículas magnéticas e pipetar fora do sobrenadante; Lavar contas revestido duas vezes com 1 ml de PBS / BSA solução tampão. Entre cada lavagem remover PBS / BSA solução. Todos etapa de lavagem foram realizados configuração esferas magnéticas e PBS / BSA em rotação misturador por 5 min; </li><li> Lavar as esferas magnéticas, uma vez com 1 ml de TRIS / BSA solução tampão. Remover TRIS / solução BSA. Realizar esta etapa definindo esferas magnéticas e TRIS / BSA em tampão rotação misturador para 4 h a 37 ° C *; </li><li> Lavar as esferas magnéticas, uma vez usando 1ml de atualizado (mantido na geladeira a 4 ° C) PBS / BSA solução tampão. Remover PBS / BSA solução. Realizar esta etapa configuração esferas magnéticas e PBS / BSA em tampão rotação misturador para 5min à temperatura ambiente; </li><li> Após a lavagem passo remover todo o líquido de lavagem e adicionar 1 ml tampão PBS + NaN 3 + BSA como líquido de armazenamento; </li><li> Loja esferas magnéticas revestidas a 4 ° C (note que revestido esferas magnéticas são estáveis ​​por pelo menos 2 meses a 4 ° C); </li></ol> * Para este efeito, o mixer é colocado no forno equipado com um buraco que permite a inserção do cabo para o fornecimento de energia. Alternativamente, o misturador pode ser colocado em uma sala termostatizado a 37 ° C. 7) A preparação das amostras e extração 25 g de amostra finamente moída (cereais bebê comida ou café da manhã) estamosighed em um copo do liquidificador e extraídas com 100 ml de acetonitrila / solução de água (86/14) por 3 min em um misturador de alta velocidade. Após centrifugação a 4000 rpm (3000 g) por 5 min, 8 ml do sobrenadante foram tomadas e purificados com coluna Mycosep, 4 ml do extrato limpas foram secas sob fluxo de nitrogênio. Amostras secas podem ser armazenadas a -30 ° C até vários meses. 8) a reconstituição da amostra Cereais de pequeno almoço Reconstituir o extrato de cereais secos pequeno-almoço (comida à base de cereais destinados ao consumo adulto) com 40 ml de PBS pH 7,4. Desta forma uma amostra com uma concentração de toxina igual ao limite legal suposto (200 ng / g) dará na etapa de medição um sinal de queda no meio da faixa de trabalho. Alimentos para bebês Reconstituir o extrato de alimentos secos baby (alimentos à base de cereais destinados ao consumo infantil) com 4 ml de PBS. Desta forma uma amostra com uma concentração de toxinas igual ao limite legal suposto (20-25 ng / g) dará na etapa de medição um sinal de queda no meio da faixa de trabalho.

<ol>
	<li>Koch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+of+trichothecenes+analysis.">State of the art of trichothecenes analysis.</a> Toxicol. Letters. 153, 109-112 (2004).</li><li>Krska, R., Baumgartner, S., Josephs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+in+the+analysis+of+type-A+and-B+trichothecene+mycotoxins+in+cereals.">State of the art in the analysis of type-A and-B trichothecene mycotoxins in cereals.</a> Fresenius J. Anal. Chem. 371, 285-299 (2001).</li><li>Morozova, T. Y., Morozov, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+differentiation+in+recognition+of+cross-reactive+antigens+by+magnetic+beads.">Force differentiation in recognition of cross-reactive antigens by magnetic beads.</a> Anal. Biochem. , 263-271 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAO+Food+and+Nutrition+Paper+74.">FAO Food and Nutrition Paper 74.</a> JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITIVES Fifty-sixth meeting. , 115 (2001).</li><li>Piermarini, S., Volpe, G., Ricci, F., Micheli, L., Moscone, D., Palleschi, G., Fuhrer, M., Krska, R., Baumgartner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Screening+Electrochemical+Methods+for+Aflatoxin+B1+and+Type-A+Trichothecenes:+a+preliminary+study.">Rapid Screening Electrochemical Methods for Aflatoxin B1 and Type-A Trichothecenes: a preliminary study.</a> Anal. Lett. 40, 1333-1346 (2007).</li><li>Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appropriate+calibration+curve+fitting+in+ligand+binding+assays.">Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays.</a> AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).</li><li>Ricci, F., Volpe, G., Micheli, l., Palleschi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+novel+developments+and+applications+of+immunosensors+in+food+analysis.">A review on novel developments and applications of immunosensors in food analysis.</a> Anal. Chim. Acta. 605 (2), 111-129 (2007).</li></ol>

O uso de anticorpos como sonda de reconhecimento biomolecular viu um uso generalizado de tecnologias de sensoriamento; metodologias de detecção imunoquímica, como os testes ELISA e Meias, são, hoje em dia, entre as plataformas mais utilizadas e aplicadas em muitos laboratórios 7. Embora essas abordagens alcançar a sensibilidade excepcional e especificidade, o objetivo principal dos muitos grupos de pesquisa nos últimos anos tem sido a melhoria e otimização de suas perform...

Reagentes <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Cloreto de potássio </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> Dihidrogenofosfato de potássio </td><td> Sigma </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> Hidrogenofosfato dissódico </td><td> Sigma </td><td> S3264 </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de sódio </td><td> Sigma </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 anidro </td><td> Sigma </td><td> M8266 </td><td></td></tr><tr><td> DEA (99,5%) </td><td> Sigma </td><td> 31589 </td><td></td></tr><tr><td> HCl 37% </td><td> Sigma </td><td> 320331 </td><td></td></tr><tr><td> H 3 BO 3 </td><td> Sigma </td><td> B6768 </td><td></td></tr><tr><td> Tris [hidroximetil]-aminometano </td><td> Sigma </td><td> 252859 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (soro albumina bovina) </td><td> Sigma </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> NaN 3 </td><td> Aldrich </td><td> 71290 </td><td></td></tr><tr><td> 1-naftil fosfato dissódico de sal </td><td> Fluka </td><td> N7255 </td><td></td></tr><tr><td> Solução de leite desnatado bloqueio - gordura do leite não seca </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-6404 </td><td></td></tr><tr><td> HT-2 conjugado com KLH (Keyhole Limpet Hemocianina), solução estoque (1 mg / ml em PBS): </td><td> Biopure </td><td> 004050 </td><td> O conjugado HT-2-KLH foi obtida por CDI-método em que o livre OH-grupos na posição 3 e 4 da toxina HT-2 foram ativados por N, N&#39;-carbonyldiimidazole (CDI) ea toxina HT ativado-2 foi deixe-a reagir com aminogroups da proteína (KLH) para gerar uma ligação carbammate estável. </td></tr><tr><td> Anticorpo marcado secundário: Anti-rato IgG (H + L) de cavalo, conjugado com fosfatase alcalina, a concentração de 1 mg / ml. </td><td> Vector Laboratories </td><td> AP-2000 </td><td></td></tr><tr><td> HT-2 </td><td> Biopure </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Esferas magnéticas: Dynabeads ® </td><td> Dynal </td><td> M-280 Tosylactivated </td><td> Concentração de 2 x 10 9 esferas / ml. </td></tr></table> Soluções <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Nome do reagente </td><td> Preparação </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Tampão fosfato salino (PBS), pH 7,4 </td><td> Dissolver 0,20 g de cloreto de potássio, 0,20 g de dihidrogenofosfato de potássio, 1,16 g de fosfato dissódico de hidrogênio e 8,00 g de cloreto de sódio em 900 ml de água </td><td></td></tr><tr><td> Dietanolamina buffer, DEA, 0,97 M + 1 mM MgCl 2 + 0,15 M KCl, pH 9,8 </td><td> Dissolver 0.0476g de MgCl 2 anidro e 7.3.59 g de KCl em ~ 300 ml de água. Após a dissolução, adicionar 51 ml da DEA (99,5%). Ajustar o pH para 9,8 com HCl (6 M). Diluir para 500 ml com água. </td><td></td></tr><tr><td> Borato tampão, 0,1 M, pH 9.5 </td><td> Dissolver 3,09 g de H 3 BO 3 em ~ 300 ml de água destilada; ajustar o pH para 9,5 com NaOH e / ou HCl (6 M ou concentrações mais baixas). Diluir para 500 ml com água destilada. </td><td></td></tr><tr><td> TRIS buffer, 0,2 M, pH 8,5 </td><td> Dissolver 3,85 g de Tris [hidroximetil] aminometano-in 100 ml de água. Acertar a pH 8,5 com NaOH e / ou HCl (6 M ou concentrações mais baixas). Diluir para 200 ml com água. </td><td></td></tr><tr><td> Tampão TRIS + BSA solução (0,1%), pH 8,4 </td><td> Dissolver 0,050 g de BSA em 50 ml de TRIS pH 8.4. </td><td> Esta solução deve ser preparada no dia de uso. </td></tr><tr><td> Tampão PBS + Tween ® 0,05% </td><td> Dissolver 0,250 g de Tween 20 em 500 ml do preparado anteriormente tampão PBS, pH 7,4 </td><td></td></tr><tr><td> Tampão PBS + BSA solução 0,1% </td><td> Dissolver 0,050 g de BSA em 50 ml de tampão PBS, pH 7.3. </td><td> Esta solução deve ser preparada no dia de uso. </td></tr><tr><td> Tampão PBS + BSA 0,1% + 0,02% NaN 3 </td><td> Dissolver 0,050 g de BSA e 0,010 de NaN 3, em 50 ml de tampão PBS, pH 7.3. </td><td> Armazenamento de solution </td></tr><tr><td> Substrato enzimático </td><td> Dissolver 0,010 g de 1-naftil sal fosfato de sódio em 100 ml de DEA pH 9.8. Envolver o balão firmemente em papel alumínio. </td><td> Esta solução deve ser preparada no dia de uso. </td></tr><tr><td> Solução de leite desnatado bloqueio </td><td> Adicionar 0,20 g de Blotting Grade Bloqueador de leite desnatado seco (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) para 200 ml de tampão PBS pH 7.3. </td><td> Esta solução deve ser preparada no dia de uso. </td></tr><tr><td> HT-2 solução estoque </td><td> Dissolver 10 mg de tricotecenos frasco toxina HT-2, em 10 ml de acetonitrila para dar uma solução com uma concentração de 1 mg / ml. </td><td> Dividir essa solução em um único uso alíquotas de 30 ml e armazená-los em menos de -30 ° C. </td></tr><tr><td> HT-2 Working solução padrão </td><td> Colocar 20 ml de HT-2 toxina solução estoque em uma de 2 ml calibrados balão volumétrico e diluir com acetonitrila para obter uma solução HT-2 de trabalho contendo 10 mg / ml de toxina tricotecenos. </td><td> Esta solução deve ser preparada no dia de uso. </td></tr><tr><td> HT-2 Trabalhando soluções de calibração </td><td> Diluir o HT-2 solução padrão de trabalho (10 mcg / ml) para preparar solução de trabalho de calibração de 100 ng / ml. Diluir HT-2 trabalham solução de calibração de 100 ng / ml para preparar soluções de calibração de trabalho das seguintes concentrações 0 (branco), 0,5, 1, 2, 4, 10 ng / ml. </td><td> Estas soluções devem ser renovadas no dia de uso. </td></tr><tr><td> HT-2 conjugado com KLH </td><td> Dividir HT-2 conjugado com KLH solução-mãe (Keyhole Limpet Hemocianina) (1 mg / ml em PBS) para uso único alíquotas de 350 mL. </td><td> Alíquotas armazenar a -30 ° C. </td></tr><tr><td> Anticorpo monoclonal específico </td><td> Diluir 1:350 (v: v) a concentração de ações (1,383 mg / ml) de anticorpo monoclonal em PBS para utilização na etapa da concorrência </td><td> Esta solução deve ser preparada no momento do uso. 10 ml de solução estoque de anticorpos em PBS para um volume final de 3,5 ml, são suficientes para analisar 17 normas e / ou amostras. </td></tr><tr><td> Anticorpo marcado secundário </td><td> IgG anti-rato (H + L), conjugada com fosfatase alcalina, diluído 1:100 (v: v) em PBS para utilização na etapa competição. </td><td> 100 mL de solução stock de anticorpos em PBS para um volume final de 10 ml, são suficientes para analisar 25 normas e / ou amostras. Esta solução deve ser preparada no momento do uso. </td></tr></table> Aparelho <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Concentrador de partículas magnéticas: MPC-S ® </td><td> Dynal </td><td></td></tr><tr><td> Instrumento PalmSens </td><td> PalmSens </td><td> Fornecido com PalmSens Lite, cabo Serial laptop PC de conexão e software opções Mux </td></tr><tr><td> CH8 PalmSens Multiplexer </td><td> PalmSens </td><td></td></tr><tr><td> Oito canais de contato elétrico Mux </td><td> feitas à mão </td><td></td></tr><tr><td> Tira com oito eletrodos serigrafados (SPEs) </td><td> feitas à mão </td><td></td></tr><tr><td> Suporte especialmente concebido para strip eletrodos </td><td> feitas à mão </td><td> Inclui 8 ímãs de neodímio cada um dos quais é colocado abaixo de cada superfície do eletrodo de trabalho da SPE </td></tr><tr><td> Calibrado pipetas microlitro </td><td> Gilson </td><td></td></tr><tr><td> Agitador magnético e bares mexa. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Copos de vidro (100, 50, 20 ml). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Balões volumétricos (2ml). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0,2 e 2 ml tubos Eppendorf. </td><td> Eppendorf </td><td></td></tr><tr><td> Tubos Falcon ™ de 5ml e 15ml. </td><td> Falcão </td><td></td></tr><tr><td> Laboratório Vortex Mixer </td><td></td><td> Não use vortex para voltar a suspender as esferas magnéticas revestidas com HT2-KLH ou ligado a cadeia imunológica para evitar a desnaturação protéica de peças </td></tr><tr><td> Forno de laboratório ou sala de termostatizado </td><td></td><td> Escolha um forno capaz de manter uma temperatura de 37 ± 3 ° C. </td></tr></table>

elime (enzyme linked immuno magnetic electrochemical) method for mycotoxin detection

Imunoensaios são uma alternativa válida para o mais caro e demorado quantitativa HPLC ou GC 1, 2 métodos para a detecção de triagem de micotoxinas perigosas em commodities de alimentos. Neste protocolo, mostramos como fabricar e interrogar uma enzima eletroquímica competitivas ligadas imunomagnética ensaio baseado no uso de esferas magnéticas como suporte sólido para a cadeia imunoquímicos 3 e eletrodos serigrafados como sensoriamento plataforma. Nosso método visa determinar a quantidade total de HT-2 e T-2 toxinas, as micotoxinas, pertencente à família tricotecenos e de grande preocupação para a saúde humana 4. A utilização de um clone de anticorpo com uma reatividade cruzada de 100% para HT-2 e T-2 permite detectar simultaneamente tanto toxinas com sensibilidade similar 5. O primeiro passo do nosso teste é a etapa de revestimento em que imobilizar HT2-KLH toxina conjugada na superfície das esferas magnéticas. Depois de uma etapa de bloqueio, necessário para evitar a não-específica absorções, a adição de um anticorpo monoclonal permite a competição entre imobilizada HT-2 e do presente livre HT-2 ou T-2 na amostra ou dissolvido em uma solução padrão. No final da etapa de competição, a quantidade de anticorpo monoclonal ligado ao imobilizado HT-2 será inversamente proporcional à quantidade de toxina na solução da amostra. Um anticorpo secundário marcado com fosfatase alcalina (AP) é usado para revelar a ligação entre o anticorpo específico ea imobilizada HT-2. A etapa de medição final é realizada por deixar cair uma alíquota de suspensão grânulo magnético, correspondente a uma determinada amostra de solução / standard, na superfície de um eletrodo serigrafado de trabalho; esferas magnéticas são imobilizados e concentrada por meio de um ímã colocado exatamente sob o serigrafado eletrodo. Após dois minutos de incubação entre as esferas magnéticas e um substrato para a AP, o produto enzimático é detectado por voltametria de pulso diferencial (DPV), utilizando um instrumento portátil (PalmSens) também capaz de iniciar automaticamente oito medidas dentro de um intervalo de poucos segundos.

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ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

Um protocolo para detectar tricotecenos (micotoxinas de interesse para a saúde humana), utilizando um método de triagem recém-desenvolvido com base em um método imunoquímico competitiva e uma detecção eletroquímica final é demonstrada.

ELIME Método (Enzyme Linked Immuno Magnetic eletroquímica) para Detecção de micotoxinas

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

elime-enzyme-linked-immuno-magnetic-electrochemical-method-for

Research

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ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

14.1K visualizações.  University of Rome, Tor Vergata. Um protocolo para detectar tricotecenos (micotoxinas de interesse para a saúde humana), utilizando um método de triagem recém-desenvolvido com base em um método imunoquímico competitiva e uma detecção eletroquímica final é demonstrada.

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Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

Detecção de Ubiquitinação Protein

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Biologia

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

Isolamento de proteínas lábeis Multi-Complexos por In vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Imuno-magnética cromatografia de afinidade

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although this modification was implicated in several biological processes, additional aspects of its function are emerging, with recent evidence of its role in the production of signals for glycoprotein quality control and trafficking. Thus, phenomena related to N-linked glycans and their processing are being intensively investigated. Methods that have been recently developed for proteomic analysis have greatly improved the characterization of glycoprotein N-linked glycans. Nevertheless, they do not provide insight into the dynamics of the sugar chain processing involved. For this, labeling and pulse-chase analysis protocols are used that are usually complex and give very low yields. We describe here a simple method for the isolation and analysis of metabolically labeled N-linked oligosaccharides. The protocol is based on labeling of cells with [2-3H] mannose, denaturing lysis and enzymatic release of the oligosaccharides from either a specifically immunoprecipitated protein of interest or from the general glycoprotein pool by sequential treatments with endo H and N-glycosidase F, followed by molecular filtration (Amicon). In this method the isolated oligosaccharides serve as an input for HPLC analysis, which allows discrimination between various glycan structures according to the number of monosaccharide units comprising them, with a resolution of a single monosaccharide. Using this method we were able to study high mannose N-linked oligosaccharide profiles of total cell glycoproteins after pulse-chase in normal conditions and under proteasome inhibition. These profiles were compared to those obtained from an immunoprecipitated ER-associated degradation (ERAD) substrate. Our results suggest that most NIH 3T3 cellular glycoproteins are relatively stable and that most of their oligosaccharides are trimmed to Man9-8GlcNAc2. In contrast, unstable ERAD substrates are trimmed to Man6-5GlcNAc2 and glycoproteins bearing these species accumulate upon inhibition of proteasomal degradation.

We describe a method for analysis of the alteration of N-linked glycans through the early life of glycoproteins after their biosynthesis in mammalian cells. This is achieved by pulse-chase analysis of metabolically labeled glycans, enzymatic release from glycoproteins and examination by HPLC.

Pulso-chase Análise de Cadeias N-linked Açúcar de Glicoproteínas em células de mamíferos

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Detecção rápida de Homogêneos Ensaios Biológicos Usando o sistema de modulação Biossensoriais Magnetic

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of acetate to acetyl phosphate utilizing ATP as a substrate. Acetate kinases are ubiquitous in the Bacteria, found in one genus of Archaea, and are also present in microbes of the Eukarya6. The most well characterized acetate kinase is that from the methane-producing archaeon Methanosarcina thermophila7-14. An acetate kinase which can only utilize PPi but not ATP in the acetyl phosphate-forming direction has been isolated from Entamoeba histolytica, the causative agent of amoebic dysentery, and has thus far only been found in this genus15,16.
In the direction of acetyl phosphate formation, acetate kinase activity is typically measured using the hydroxamate assay, first described by Lipmann17-20, a coupled assay in which conversion of ATP to ADP is coupled to oxidation of NADH to NAD+ by the enzymes pyruvate kinase and lactate dehydrogenase21,22, or an assay measuring release of inorganic phosphate after reaction of the acetyl phosphate product with hydroxylamine23. Activity in the opposite, acetate-forming direction is measured by coupling ATP formation from ADP to the reduction of NADP+ to NADPH by the enzymes hexokinase and glucose 6-phosphate dehydrogenase24.
Here we describe a method for the detection of acetate kinase activity in the direction of acetate formation that does not require coupling enzymes, but is instead based on direct determination of acetyl phosphate consumption. After the enzymatic reaction, remaining acetyl phosphate is converted to a ferric hydroxamate complex that can be measured spectrophotometrically, as for the hydroxamate assay. Thus, unlike the standard coupled assay for this direction that is dependent on the production of ATP from ADP, this direct assay can be used for acetate kinases that produce ATP or PPi.

A method for the determination of acetate kinase activity is described. This assay utilizes a direct reaction for determining enzyme activity and kinetics of acetate kinase in the acetate-forming direction with different phosphoryl acceptors. Furthermore, this method can be utilized for assaying other acetyl phosphate or acetyl-CoA utilizing enzymes.

Detecção direta da Atividade Acetato de formação do Acetato Quinase Enzima

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

Bioensaio eletroantenográfica como uma ferramenta de triagem para voláteis da planta hospedeira

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for developing severe infection. Many laboratory methods for the detection of CMV infection have been developed, including serology, viral culture, and molecular methods. Often, these methods reflect systemic involvement with CMV and do not specifically identify local tissue involvement. Therefore, detection of CMV infection in the GI tract is frequently done by traditional histology of biopsy tissue. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining in conjunction with immunohistochemistry (IHC) have remained the mainstays of examining these biopsies. H&#38;E and IHC sometimes result in atypical (equivocal) staining patterns, making interpretation difficult. It was shown that quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for CMV can successfully be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue for very high sensitivity and specificity. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform qPCR testing for the detection of CMV in FFPE biopsy tissue in a clinical laboratory setting. This method is likely to be of great benefit for patients in cases of equivocal staining for CMV in GI biopsies.

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

qPCR é um método sensível e rápido para detecção de DNA por citomegalovírus em formalina-fixo, tecido da biópsia de parafina-embedded

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

Multi-enzima Triagem Usando um de alta capacidade Enzyme genética Sistema de Triagem

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension with&#160;intact cell or nuclei involves dissociation and permeabilization, steps that can introduce unwanted noise and undesirable damage. Particularly, certain cell-types such as neurons are challenging to dissociate into individual cells. Additionally, permeabilization of the cellular membrane to release nuclei requires optimization by trial-and-error, which can be time consuming, labor intensive and financially nonviable. To enhance the robustness and reproducibility of sample preparation for high-throughput sequencing, we describe a rapid enzyme and detergent-free column-based nuclei isolation method. The protocol enables efficient isolation of nuclei from the entire zebrafish brain within 20 minutes. The isolated nuclei display intact nuclear morphology and low propensity to aggregate. Further, flow cytometry allows nuclei enrichment and clearance of cellular debris for downstream application. The protocol, which should work on soft tissues and cultured cells, provides a simple and accessible method for sample preparation that can be utilized for high-throughput profiling, simplifying the steps required for successful single-nuclei RNA-seq and ATAC-seq experiments.

Single nuclei isolation relies on dissociation and detergent-based permeabilization of the cell membrane, steps that need optimization and are prone to introducing technical artifacts. We demonstrate a detergent and enzyme-free protocol for rapid isolation of intact nuclei directly from whole tissue, yielding nuclei suitable for single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) or ATAC-seq.

Isolamento de núcleos de tecido inteiro usando um método detergente e sem enzimas

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Plasmodium sporozoites are the infective stage of malaria parasites that infect humans. The sporozoites residing in the salivary glands of female Anopheles mosquitoes are transmitted to humans via mosquito bites during blood feeding. The presence of sporozoites in the mosquito salivary glands thus defines mosquito infectiousness. To determine whether an Anopheles mosquito carries Plasmodium sporozoites, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method has been the standard tool to detect the Plasmodium circumsporozoite protein (CSP), the major surface protein of the sporozoites. In this method, the head along with the thorax of each mosquito is separated from the abdomen, homogenized, and subjected to a sandwich ELISA to detect the presence of CSP specific to Plasmodium falciparum and each of the two subtypes, VK210 and VK247, of Plasmodium vivax.This method has been used to study malaria transmission, including the seasonal dynamics of mosquito infection and the species of the major malaria vectors in the study sites.

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

This protocol describes a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to detect salivary gland sporozoites in mosquitoes. Using easily available monoclonal antibodies, the method enables cost-effective, high-throughput detection of mosquitoes carrying Plasmodium falciparum or Plasmodium vivax. The method is suitable for malaria transmission research, including vector surveys.