Este trabalho foi financiado em parte pelo National Science Foundation (CBET 0.846.453).

1. Fabricação de mestres de silício usando fotolitografia SU-8 padrão 1 (não é mostrado neste vídeo). <ol><li> Uso padrão SU-8 métodos de fotolitografia para criar um SU-8 &quot;master&quot; (SU-8 2025, Microchem, Newton, MA) para a fabricação do molde PDMS que contém a rede microfluídicos e câmara de quimiotaxia. Moldes como mestre pode ser fabricado em qualquer instalação de microfabricação (por exemplo, Stanford microfluídica Fundição; <a href="http://thebigone.stanford.edu/foundry/">http://thebigone.stanford.edu/foundry/</a> ). </li><li> Antes da replicação do PDMS, exponha o SU-8 master vapor fluorosilane em um dessecador conectado a uma fonte de vácuo para facilitar a liberação fácil de PDMS do mestre. Adicionar uma gota de fluorosilane para uma toalha de papel e aplicar vácuo para uma min. Remova a vácuo e aguarde 30 min para a deposição de fluorosilane. Mantenha o mestre SU-8 em um recipiente fechado para uso futuro. </li></ol> 2. Moldagem réplica de PDMS de SU-8 master: A camada fluídica ea camada de controle são feitos por moldagem réplica de PDMS de SU-8 master. <ol><li> Misture o PDMS pré-polímero e cross-linker em um wt 10:01. relação e desgaseificar em um dessecador por 1 hora (ou até que as bolhas de ar são removidos da mistura de PDMS). </li><li> Coloque o mestre-8 SU numa placa de Petri e cuidadosamente despeje a mistura PDMS em cima do mestre SU-8 com a espessura desejada. </li><li> Aqueça a placa de petri contendo o PDMS eo SU-8 molde mestre em 80 ° C por duas horas para curar o PDMS. </li><li> Remover o curado PDMS coberto SU-8 mestre da placa e casca do molde PDMS do SU-8 master. A estrutura desejada será incorporado no molde PDMS. </li><li> Faça furos no molde PDMS para tubulação para o gerador de gradiente e de entrada de células usando uma agulha de calibre 20 blunt-end. </li></ol> 3. Colagem de PDMS dispositivos: <ol><li> Limpe uma lâmina de vidro com isopropanol e seco com nitrogênio ou um fluxo de ar. </li><li> Expor o PDMS e vidro deslizante para plasma de oxigênio em um asher plasma. </li><li> Traga o molde PDMS em contato com a lâmina de vidro. Aqueça o slide contactado e mofo PDMS a 65 ° C por 15 min. </li></ol> 4. A montagem do dispositivo de PDMS <ol><li> Usando uma lâmina de barbear, cortar tubos em um ângulo de 45 ° para o comprimento correto necessário para o dispositivo. </li><li> Insira uma extremidade do tubo nos orifícios perfurados no dispositivo (por exemplo, saída) usando uma pinça. </li><li> Utilizando uma pinça, insira uma agulha de calibre 30 sem corte na outra extremidade do tubo. </li><li> Repita o passo 4.2 para todos os buracos restantes. </li><li> Coletar 1 ml de quimiotaxia buffer (CB) em uma seringa de 3ml, tendo o cuidado de remover bolhas de ar da seringa. </li><li> Fixar um hub agulha para uma extremidade da tubulação de saída. </li><li> Adicionar CB ao hub agulha, e toque no hub agulha para remover quaisquer bolhas de ar. </li><li> Empurrar um pouco para fora CB da ponta da seringa e conecte a seringa 3mL ao hub agulha sem aprisionamento de ar. </li><li> Empurre CB através do dispositivo até que todos os hubs agulha restantes são preenchidos com a CB. Isso deve remover a maioria das bolhas de ar. </li><li> Preencher duas seringas com 500μL CB contendo as concentrações adequadas dos chemoeffector sendo testado. Eliminar a formação de bolhas de ar empurrando uma pequena gota do conteúdo da seringa e tocar a gota do líquido no hub agulha e anexando. </li><li> Da mesma forma, conectar uma seringa contendo CB para a entrada de bactérias. Este será removida quando as bactérias são introduzidas no dispositivo. </li></ol> 5. Crescimento de E. altamente móveis coli <ol><li> Crescer durante a noite culturas de E. coli RP437 com uma expressão de GFP plasmídeo em 20 mL de caldo de triptona (TB) em 32 ° C com agitação. Adicionar concentrações adequadas de antibiótico para manter o plasmídeo. Em nosso protocolo, usamos um pCM182 baixa cópia do plasmídeo para a detecção de bactérias com base na fluorescência no dispositivo. Para E. coli, as culturas a crescer a 32 ° C é recomendado para alta motilidade, sendo a mobilidade é menor em temperaturas mais altas. </li><li> Use a cultura durante a noite para inocular uma cultura de 20 mL de TB em um erlenmeyer de 250 mL de densidade óptica, a 600nm de ~ 0,05. Crescer a cultura com agitação a 32 ° C. </li><li> Colher as células em uma OD de 600 ~ 0,35 0,45 pela baixa velocidade de centrifugação a 400 xg por 5 min. </li><li> Ressuspender as células a uma OD de 600 ~ 0,35 em CB contendo o chemoeffector na concentração esperada no meio do canal. </li><li> Adicionar RFP marcado células mortas em uma OD de 600 ~ 0,35 para as células expressando GFP-viver. Os mortos (vermelho), as células são usados ​​como um controle interno para assegurar que qualquer migração não é devido aos efeitos de fluxo. </li></ol> 6. Quimiotaxia de monitoramento <ol><li> Remover alguns dos CB da agulha de entrada celularhub. Refil com a suspensão de células. </li><li> Preencha cuidadosamente a seringa 50μL com as células ressuspenso. Esta etapa deve ser feito lentamente como flagelos pode ser cortado e vai reduzir a motilidade. </li><li> Conecte a seringa 50μL para o hub de entrada agulha conforme descrito nas etapas passo 4.10. </li><li> A posição do dispositivo no palco de um microscópio de fluorescência equipado com uma câmera de alta velocidade para aquisição de imagem. Coloque as seringas de entrada (tanto os 500 seringas gradiente mL e 50 mL seringa de células) na bomba de seringa e iniciar o fluxo de tal forma que o gradiente é formado e células estão fluindo através do tubo. </li><li> Uma vez que as células entram na câmara de quimiotaxia, espere ~ 20 min para o sistema se estabilize antes de imagem. </li><li> Colete verde (ao vivo) e vermelho (mortos) imagens de fluorescência em diferentes locais ao longo do comprimento da câmara (correspondentes a diferentes tempos de exposição). Normalmente, coletamos 100 imagens de cada local em intervalos de 3 segundos. </li></ol> 7. Análise de dados: Os seguintes passos podem ser realizadas usando qualquer programa de análise de imagem disponível no mercado (por exemplo, ImageJ, Metamorph) ou usando códigos simples escrito em Matlab. <ol><li> Remover os pixels na imagem de fundo (ou seja, regular a intensidade do pixel limiar e remover todos os pixels que têm intensidade menor do que o limiar). Este ruído minimiza na análise. </li><li> Use a posição das células mortas (fluorescência vermelha) para determinar o centro da imagem. Uma vez que as células mortas não mostram quimiotaxia, esta representa a posição onde as células entraram na câmara de quimiotaxia e seria detectada na ausência de qualquer migração. </li><li> Localizar células vivas (fluorescência verde) na imagem. </li><li> Divide a imagem em canais e determinar o número de células vivas em cada canal. Em nosso trabalho anterior 3, a 1050 m de largura quimiotaxia câmara foi dividida em 64 canais que são cada ~ 16 m de largura. </li><li> Repita os passos 7,1 7,3 para todas as imagens e soma a contagem celular total para cada canal em todas as imagens. Isto dá a contagem de células total detectado em cada canal ao longo da duração do experimento. </li><li> Calcular o coeficiente de partição quimiotaxia (CPC), que representa a direção da migração, da seguinte forma: Cada célula localizada na alta concentração (direita) e baixa concentração (à esquerda) os lados das células mortas é atribuído um multiplicador de +1 e -1 , respectivamente. Isto é, uma célula que migra de um gradiente é multiplicado por um, enquanto as células se movendo para baixo o gradiente são multiplicados por -1. Todos os valores multiplicados são somados e normalizados para o número total de células detectadas. Por exemplo, um valor de CPC de 0,40 indica que 40% a mais do total de bactérias mudou-se para o lado concentração elevada do que o lado de baixa concentração (ou seja, o chemoeffector é um atrativo a mais bactérias foram detectadas movendo-se o gradiente). </li><li> Calcular o coeficiente de migração quimiotaxia (CMC), que pesa a migração de células, a distância percorrida, como segue: contagem de Peso da célula em cada canal por um fator que é proporcional à distância que as células migram. Uma célula que se move para a posição mais distante de alta concentração (canal 64) é dado um factor de ponderação de 1, enquanto que aquele que se move na metade do lado maior concentração é dado um factor de ponderação de 0,5, e uma célula de se mudar para o mais distante baixa concentração de posição é ponderada por -1. Soma-se todas as contagens de células ponderada e normalizar o número de células para gerar o CMC. </li></ol> Resultados representante 3,4: Temos utilizado o dispositivo micro (Figura 1A) descrito aqui para investigar quimiotaxia de E. coli em gradientes de atrativos (ácido aspártico, autoinducer-2) e repelentes (NISO 4, indole) 3,4. O protótipo tensão quimiotaxia 5 E. coli expressando GFP RP437 foi utilizado, juntamente com canamicina-morto E. coli TG1 células expressando a proteína fluorescente vermelha para monitorar os efeitos de fluxo. O gradiente de concentração formado no dispositivo μFlow é mostrado na Figura 1B. A entrada de celulares foi tampado para que não havia fluxo através dele e um gradiente estável de 0 a 100 ng / mL de fluoresscein foi estabelecido no dispositivo. A intensidade dos pixels através do dispositivo foi utilizado para determinar o perfil de concentração de fluoresceína. Os dados mostram que as bactérias encontram um gradiente linear quando entram na câmara de quimiotaxia. Figura 2A e B mostra imagens de fluorescência de E. migrando RP437 coli em resposta a gradientes de ácido aspártico (0 100 mM) e Niso 4 (0 225 mM). As respostas observadas para essas attractant canônica e repelente são como previsto. Figura 3A mostra a distribuição quantificada da E. coli RP437 na ausência de um gradiente de concentração (ou seja, gradiente nulo de ácido aspártico), enquantoFiguras 3B e C mostram a distribuição em gradientes de ácido aspártico ea NISO 4. A especificidade dessas respostas (ou seja, o viés da migração) é evidente como E. RP437 coli Δ tar tensão (ie, sem a tensão quimiorreceptora Tar que é usado em E. coli para detectar o ácido aspártico e níquel) não demonstra a tendência da migração na presença de um gradiente de concentração de ácido aspártico ou NISO 4. As tendências evidentes nos perfis de distribuição espacial também são consistentes com os valores calculados e CPC CMC. Os valores de CPC para a migração de E. coli RP437 em gradientes de ácido aspártico ou NISO 4 são 0,33 e -0,33, respectivamente. Os valores correspondentes CMC são 0,13 e -0,14, respectivamente. Em contraste, o CPC ea CMC valores com o E. coli RP437 Δ tensão tar em gradientes de ácido aspártico ou NISO 4 são desprezíveis. Além disso, o CPC e CMC em um gradiente nulo de ácido aspártico são 0,03 e 0,02, respectivamente, e indicam a falta de parcialidade na migração, na ausência de um gradiente. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig1a.jpg" alt="Figura 1a" /> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig1b.jpg" alt="Figura 1b" /> Figura 1. Esquemática do dispositivo e gradiente de concentração. (A) Representação esquemática do dispositivo quimiotaxia microfluídicos. O dispositivo consiste de um módulo de gradiente de mistura (20 x 100 x 18.750 mm) e um módulo quimiotaxia de observação (20 x 1050 x 11500 mm). As larguras dos dois canais gradiente de entrar no dispositivo são 500 mm ea largura da entrada da bactéria é 50 mm. A inserção mostra um gradiente de molécula sinalizadora (cinza) e bactérias migrar em resposta a ele. Bactérias vivas são descritas como formas ovais sólida, enquanto que bactérias mortas são mostrados como ovais aberto. (B) um gradiente de concentração entre 0 e 100 ng / mL de fluoresceína foi gerada no dispositivo e fotografada usando microscopia de fluorescência. Imagens de fluorescência foram adquiridas após 30 min e quantificadas por análise de imagem. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Quimiotaxia de E. coli RP437 no dispositivo microfluídicos. E. coli RP437 foi exposto a um gradiente de (A) 0-100 mM L-aspartato ou (B) 0-225 mM NISO 4 no dispositivo e a migração de bactérias vivas (verde) em direção a L-aspartato ou longe de níquel imaged cada segundo de 2,5 para 30 min. Bactérias mortas (vermelho) serviu como controle dos efeitos de fluxo no dispositivo. As imagens foram quantificados utilizando um in-house desenvolveu análise Program3. Os dados apresentados são representativos pseudo-colored imagens a partir de três experimentos independentes. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3a.jpg" alt="Figura 3a" /> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3b.jpg" alt="Figura 3b" /> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3c.jpg" alt="Figura 3c" /> Figura 3: Quantificação de perfis de migração para um atrativo canônica e repelente. Distribuição espacial da RP437 no dispositivo microfluídicos em resposta a (A) 100 uniformes mM L-aspartato (ie, sem gradiente), (B) um 0 gradiente M 100 de aspartato, e (C) um 0 gradiente M 225 da NISO 4 . A distribuição de células mortas é mostrado como uma linha sólida, a distribuição das células RP437 é mostrado como uma linha tracejada, ea distribuição de células RP437 eda + Δ tar é mostrado como uma linha pontilhada. Os dados apresentados são uma média de três experimentos independentes.

<ol>
	<li>McDonald, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prototyping+of+microfluidic+devices+in+poly(dimethylsiloxane)+using+solid-object+printing.">Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing.</a> Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).</li><li>Hansen, M. C., Palmer, R. J. J., Udsen, C., White, D. C., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+GFP+fluorescence+in+cells+of+Streptococcus+gordonii+under+conditions+of+low+pH+and+low+oxygen+concentration.">Assessment of GFP fluorescence in cells of Streptococcus gordonii under conditions of low pH and low oxygen concentration.</a> Microbiol. 147, 1383-1391 (2001).</li><li>Englert, D. L., Manson, M. D., Jayaraman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Flow-Based+Microfluidic+Device+for+Quantifying+Bacterial+Chemotaxis+in+Stable,+Competing+Gradients.">A Flow-Based Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable, Competing Gradients.</a> Appl Environ Microbiol. 75, 4557-4564 (2009).</li><li>Englert, D. L., Jayaraman, A., Manson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microfluidic techniques for the analysis of bacterial chemotaxis. , (2009).</li><li>Mao, H., Cremer, P. S., &amp;amp, M. a. n. s. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive,+versatile+microfluidic+assay+for+bacterial+chemotaxis.">A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis.</a> PNAS. 100 (9), 5449-5454 (2003).</li></ol>

O coeficiente de partição quimiotaxia (CPC) eo coeficiente de migração quimiotaxia (CMC) pode ser calculado como descrito na Mao et al 5. Se uma célula é detectada no lado de alta concentração, é dado um valor de 1, enquanto que uma célula detectada no lado de baixa concentração é dado um valor de -1. Os valores são somados e divididos pelo número total de células para gerar o CPC. O sinal do CPC (positivo ou negativo) dá a direção da migração (ou para longe de um sinal). Embora...

a microfluidic device for quantifying bacterial chemotaxis in stable concentration gradients

Quimiotaxia permite que as bactérias abordagem fontes de produtos químicos ou atrativo para evitar fontes de produtos químicos repelentes. Bactérias monitorar constantemente a concentração de chemoeffectors específicas, comparando a concentração atual para a concentração detectados alguns segundos antes. Esta comparação determina a direção líquido de movimento. Embora múltiplos, gradientes concorrentes freqüentemente coexistem na natureza, abordagens convencionais para investigar quimiotaxia bacteriana são de qualidade inferior para a quantificação da migração em resposta a gradientes de concentração de atrativos e repelentes. Aqui, descrevemos o desenvolvimento de um modelo de quimiotaxia microfluídicos para a apresentação de gradientes de concentração precisa e estável de chemoeffectors a bactérias e quantitativamente a investigar sua resposta ao gradiente aplicado. O dispositivo é versátil na medida em que gradientes de concentração de qualquer concentração desejada absoluta e força de gradiente pode ser facilmente gerado pela mistura difusivo. O dispositivo é demonstrada usando a resposta de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; RP437 a gradientes de aminoácidos e íons níquel.

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A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Este protocolo descreve o desenvolvimento de um dispositivo micro para investigar quimiotaxia bacteriana em gradientes de concentração estável de chemoeffectors.

Um dispositivo micro para Quantificar Quimiotaxia bacteriana em gradientes de concentração estável

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.1K visualizações.  Texas A&M University. Este protocolo descreve o desenvolvimento de um dispositivo micro para investigar quimiotaxia bacteriana em gradientes de concentração estável de chemoeffectors.

Vídeo: A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Studies of Bacterial Chemotaxis Using Microfluidics - Interview

Estudos de Quimiotaxia bacteriana Usando microfluídica - Entrevista

Biologia

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for culturing neurons. Previously, a silicon wafer was patterned with the design for the neuron microfluidic device using SU-8 and photolithography to create a master mold, or what we simply refer to as a "master". Next, we pour the silicon polymer PDMS on top of the master which is then cured by heating the PDMS to 80&deg;C for 1 hour. The PDMS forms a negative mold of the device. The PDMS is then carefully cut and lifted away from the master. Holes are punched where the reservoirs will be and the excess PDMS trimmed away from the device. Nitrogen is used to blow away any excess debris from the device. At this point the devices are now ready for use and can either bonded to corning No. 1 cover glass with a plasma sterilizer/cleaner or can be reversibly bound to the cover glass by simply placing the device on top of the cover glass. The reversible bonding of the device to glass is covered in a separate video and requires first that the device be sterilized either with 70% ethanol or by autoclaving. Plasma treating sterilizes the devices so no further treatment is necessary. It is, however, important, when plasma-treating the devices, to add liquid to the devices within 10 minutes of the plasma treatment while the surfaces are still hydrophilic. Waiting longer than 10 minutes to add liquid to the device makes it difficult for the liquid to enter the device. The neuron devices are typically plasma-bound to cover glass and 0.5 mg/ml poly-L-lysine (PLL) in pH 8.5 borate buffer is immediately added to the device. After a minimum of 3 hours incubating with PLL, the devices are washed with dH2O water a minimum of 3 times with at least 15 minutes between each wash. Next, the water is removed and fresh media is added to the device. At this point the device is ready for use. It is important to remember at this point to never remove all the media from the device. Always leave media in the main channel.

In this video we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to farbricate a microfluidic device for culturing neurons.

Fabricação de um dispositivo micro para a compartimentação de Neuron Soma e axônios

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Um dispositivo micro com padrões Groove para estudar o comportamento celular

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

Um dispositivo de geração de Gradient microfluídicos de Biologia Celular

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously dissected and prepared. The E18 cortex is, upon dissection, immediately dissociated into individual neurons. It is possible to store E18 cortex in Hibernate E buffer containing B27 at 4&deg;C for up to a week before the dissociation is performed. However, there will be a drop in cell viability. Typically we obtain our E18 Cortex fresh. It is transported to the lab in ice cold Calcium free Magnesium free dissection buffer (CMFM). Upon arrival, trypsin is added to the cortex to a final concentration of 0.125%. The cortex is then incubated at 37&deg;C for 8 minutes. DMEM containing 10% FBS is added to the cortex to stop the reaction. The cortex is then centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is removed and 2 ml of Neural Basal Media (NBM) containing 2% B27 (vol/vol) and 0.25% Glutamax (vol/vol) is added to the cortex which is then re-suspended by pipetting up and down. Next, the cortex is triturated with previously fire polished glass pipettes, each with a successive smaller opening. After triturating, the cortex is once again centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is then removed and the cortex pellet re-suspended with 2 ml of NBM containing B27 and Glutamax. The cell suspension is then passed through a 40 um nylon cell strainer. Next the cells are counted. The neurons are now ready for loading into the neuron microfluidic device.

In this video we demonstrate the preparation of E18 Cortical Rat Neurons.

Preparando E18 neurônios de rato para Cortical Compartimentação em um dispositivo micro

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-linfócitos Captura Usando um chip descartável microfluídicos para HIV

Cell Capture Using a Microfluidic Device

Captura de célula usando um dispositivo micro

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is largely due to the difficulty with which one can create a cell-compatible and steady microenvironment using conventional microfabrication techniques and materials. We address this problem via the introduction of a novel microfabrication material, agarose gel, as the base material for the microfluidic device. Agarose gel is highly malleable, and permeable to gas and nutrients necessary for cell survival, and thus an ideal material for cell-based assays. We have shown previously that agarose gel based devices have been successful in studying bacterial and neutrophil cell migration2. In this report, three parallel microfluidic channels are patterned in an agarose gel membrane of about 1mm thickness. Constant flows with media/buffer are maintained in the two side channels using a peristaltic pump. Cells are maintained in the center channel for observation. Since the nutrients and chemicals in the side channels are constantly diffusing from the side to center channel, the chemical environment of the center channel is easily controlled via the flow along the side channels. Using this device, we demonstrate that the movement of neural stem cells can be monitored optically with ease under various chemical conditions, and the experimental results show that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells. Motility of neural stem cells is an important biomarker for assessing cells aggressiveness, thus tumorigenic factor3. Deciphering the mechanism underlying NSC motility will yield insight into both disorders of neural development and into brain cancer stem cell invasion.

We demonstrate that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells(NSCs) using a novel agarose gel based microfluidic device. This technology can be readily adaptable to other mammalian cell systems where cell sources are scarce, such as human neural stem cells, and the turn around time is critical.

Avaliar motilidade celular Neural Stem Usando um dispositivo Agarose Gel baseado microfluídicos

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Geração de transgênicos Estável C. elegans Usando microinjeção

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes. The device consists of three layers: first layer contains an array of microscale wells (500 &mu;m diameter and 150 &mu;m depth) that help to immobilize the islets while exposed to flow and maximize the exposed surface area of the islets; the second layer contains a circular perifusion chamber (3 mm deep, 7 mm diameter); and the third layer contains an inlet-mixing channel that fans out before injection into the perifusion chamber (2 mm in width, 19 mm in length, and 500 &mu;m in height) for optimizing the mixing efficiency prior to entering the perifusion chamber. The creation of various glucose gradients including a linear, bell shape, and square shapes also can be created in the microfluidic perifusion network and is demonstrated.

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes.

A Multi-Parametric Sistema Perifusion Islet dentro de um dispositivo Perifusion microfluídicos

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence ...