Este trabalho foi suportado por concessões do National Institutes of Health (ES07408 e EB00208).

1. ECIS / Taxis Preparação do eletrodo <ol><li> A superfície de ouro do conjunto de eléctrodos ECIS / táxis (consistindo de 8 câmaras por lâmina) é primeiro estabilizada por pré-tratamento com cisteína 10 mM em água desionizada estéril (dH2O) durante 15 min à temperatura ambiente sob condições estéreis. </li><li> Aspirar a solução de cisteína a partir de cada câmara de eléctrodo, lavar 3 vezes com dH2O estéril, e substituir com 250 uL de meio completo (RPMI 1640, 10% de FBS, 25 mM de tampão HEPES). </li><li> Conecte o conjunto de eletrodos de entrar em contato com pinos titular matriz instrumento para realizar seleção de eletrodos. </li><li> Câmaras que estejam devidamente conectados será destacado em verde na tela do computador. Se as câmaras são destacadas em vermelho, eles não estão conectados eo eletrodo deve ser re-posicionado no porta-matriz para estabelecer contatos para todas as câmaras. </li><li> Uma vez que todas as câmaras estão conectados, clique no botão &quot;Check&quot; no controlador de software para impedirmina a resistência inicial e os valores de capacitância para cada câmara. Os valores de resistência deve ser entre 1600 e 2000 ohms, e os valores de capacitância deve ser entre 5 e 6 nanofarads para uma matriz de câmara 8. Se uma câmara não está dentro destes parâmetros aceitáveis, a câmara de indivíduo não deve ser usado para recolher dados. </li><li> Desligue o eléctrodo a partir do detentor matriz para preparar as câmaras individuais de agarose. Aspirar meio de câmaras e lave cada câmara de 3 vezes com estéril dH 2 O. </li></ol> 2. Preparando Agarose Chambers <ol><li> Em um tubo de polipropileno estéril 15 ml, g medida 0,03 de SeaKem GTG agarose e adicionar 1 ml de PBS estéril. Recoloque a tampa do tubo solto, e derreter a agarose em autoclave para um ciclo de 2 min líquido (fusão em um forno de microondas não é eficaz para este ensaio). Este curto período de tempo não vai derreter o tubo cônico. Para as células menos exigentes que não requerem soro para a cultura, (por exemplo, Dictyostelium discoideum) 0,5%agarose pode ser feita no meio apropriado e fundido num forno de microondas. O autoclave é necessário para as células que requerem soro, como isso será desnaturada se derretido em microondas. </li><li> Adicionar 5 ml de meio RPMI completo aquecida num banho de água (55 ° -60 ° C) directamente à agarose quente, para uma concentração final de 0,5% de agarose e pipeta-se e suavemente para baixo para misturar. </li><li> Pipete 300 de meio de agarose derretido em cada câmara, substituir os ECIS / tampa matriz táxis e permitir ao gel à temperatura ambiente. </li><li> Pipetar restante de agarose em tampão de 15 ml para avaliar tubo de gelificação de agarose. Este excesso de agarose irá também ser utilizado, em parte, 4: Corte poços em agarose. </li></ol> 3. Construir e afiar a cânula Ferramenta Bem Cutting <ol><li> Afiar duas calibre 14 cânulas extremidade romba, utilizando um 5/64 bits &quot;. Rodar a ponta da broca de perfuração em cada abertura cânula com uma broca de velocidade lenta, certificando-se que a broca corta borda interior inteiro de cada op cânulaening para formar uma aresta de corte afiada (Figura 4A). </li><li> Faça dois furos com 1 &quot;x 2&quot; x ¼ &quot;plexiglass (Figura 4B-D) com um 5/64&quot; bits em uma imprensa de broca. Insira cada cânula afiada calibre 14 para que ele se projeta uma distância igual através de cada furo plexiglass. </li></ol> 4. Corte Wells em Agarose <ol><li> Esterilizar as cânulas de calibre 14 levemente as pontas de fogo. Antes do corte poços na câmara de ECIS, permitir que a cânula a arrefecer até à temperatura ambiente, ou refrigerar o cânulas tocando a agarose na tampa do tubo de 15 ml. Se a temperatura da cânula é demasiado elevado, a agarose derreterá como os poços de câmara são cortadas, tornando os poços deformado e defeituoso. </li><li> Alinhar o par cânula acima os dois pontos de ouro em torno do eléctrodo alvo em cada câmara (Figura 2c e 5). Inserir o verticalmente cânula, sem qualquer movimento horizontal, parando em contacto suave entre a cânula eosuperfície do eletrodo. Cuidadosamente remover a cânula, novamente sem qualquer movimento horizontal. Colocação de poços adicionais para se opor gradientes também é possível com uma reconfiguração do gabarito cânula. </li><li> Aspirar cuidadosamente a ficha de agarose deixado pela cânula, utilizando uma agulha estéril 9 &quot;pipeta de Pasteur, ligado a pressão de vácuo de baixa, com uma armadilha de vácuo pegar resíduos de agarose. </li><li> Adicionar 300 ul de meio completo RPMI para a superfície de cada câmara a 37 ° C, durante 2 min para saturar a agarose, e, em seguida, aspirar cuidadosamente os meios de comunicação a partir da superfície e os poços sem perturbar a agarose. </li></ol> 5. Carregando o Wells <ol><li> Cada poço é capaz de manter um volume de 7 uL. Para um poço em cada câmara, adicionar 7 uL de suspensão de células. Para as células de Jurkat T, utilizar 2 x10 7 células / ml. Estas células irá responder a 7 uL de 200 ng / ml SDF-1α diluído em meio RPMI incompleta, que carece de soro. Use a mídia completos sozinho como um cont negativorol. </li><li> Depois de as cavidades são carregados, ver cada câmara da matriz com um microscópio invertido para assegurar que todos os poços foram cortadas e encheu adequadamente. As células devem estar em dentro dos limites de fronteira do poço. Se eles são vistos em ambos os poços, ou estão se espalhando para além das fronteiras da célula bem, então uma lacuna se formou sob a agarose. Observe os poços indevidamente criadas, pois os dados não podem ser seguramente interpretadas a partir dessas câmaras. </li></ol> 6. Coleta de Dados <ol><li> Coloque o eletrodo no suporte da matriz e re-conectar as pastilhas de ouro no conjunto de eletrodos para os pinos de mola pogo do titular e clique em &quot;setup&quot;. Os poços que estão conectados corretamente será destacada em verde. Se os poços são vermelhos, eles não estão conectados eo eletrodo deve ser colocada no porta-matriz. </li><li> Selecione &quot;8WE1&quot; (8 eletrodo bem 1) a partir do menu drop-down no painel de software para indicar a configuração da matriz. </li><li> Selecione &quot;verificar&quot; no software contrpainel ol para determinar a resistência inicial e valores de capacitância para cada poço. Os valores de resistência deve ser entre 1600 e 2000 ohms, enquanto que os valores de capacitância deve ser entre 5 e 6 nanofarads. </li><li> Selecione múltiplas freqüências para medir a resistência em diversas freqüências. Há uma opção de personalização de freqüências, ou usando um conjunto de freqüências recomendadas. As configurações padrão de aquisição de múltiplas freqüências capturar dados em 11 freqüências predefinidas (52,5, 125, 250, 500, 1.000, 2.000, 4.000, 8.000, 16.000, 32.000 e 64.000 Hz) a uma taxa de 8 poços / min. O intervalo de tempo entre as medidas também podem ser personalizados. Coleta de dados com múltiplas frequências permite a análise de capacitância, resistência, impedância e. Coleta de valores de resistência a 4.000 Hz é geralmente suficiente para estudos de quimiotaxia de células de mamífero, mas as freqüências adicionais podem fornecer informações em outros contextos 12,13. </li><li> A duração da experiência total pode ser definido, na mão direitapainel, ou o experimento pode ser parado manualmente, clicando em &quot;finish&quot; uma vez que as células produziram resistência que são indicativos de chegada ao eletrodo. O tempo que leva para as células para se chegar ao eléctrodo depende do tipo de célula utilizada. </li><li> Clique em &quot;Iniciar&quot; para iniciar a coleta de dados. </li></ol> 7. Gerenciamento de Dados <ol><li> Embora os dados podem ser exportados para o Excel, o software ECIS 1600R, que acompanha o sistema ECISθ é o método mais eficiente para analisar dados ECIS / táxis. </li><li> O software de dados barra de ferramentas de análise contém os botões Z, R e C. Estes determinar se a resistência de impedância, ou capacitância, respectivamente, é plotado no eixo vertical contra o eixo x (tempo decorrido). </li><li> ECIS / táxis de dados é apresentado de forma mais eficiente como a resistência ao longo do tempo a 4.000 Hz. Flutuações rápidas na resistência, ou microtransients (Figura 1), são a prova de movimento celular sobre o eléctrodo. Compilando, obinning r os pontos de dados de modo que nem todos os pontos são representados graficamente, não é recomendado para ECIS / Taxis, uma vez que irá microtransients média a partir dos dados. </li><li> Uma vez que o gráfico foi feito com o software ECIS1600R, pode ser exportado, escolhendo &quot;gráfico de exportação&quot; no menu arquivo e salva como um arquivo. Tif ou. Jpg. </li></ol> 8. Os resultados representativos Cellular quimiotaxia é indicado por um aumento da resistência a 4.000 Hz. A chegada de células sobre o eléctrodo alvo também é indicada pelo aparecimento das flutuações rápidas na resistência chamados microtransients, ou micromovimento como descrito no Opp et. ai., 2009 (Figura 1) 14. Um resultado negativo é indicado por consistente, ou uma ligeira diminuição, da resistência a 4.000 Hz, como se vê em vermelho na Figura 1. A ausência de microtransients é também um sinal de uma ausência de movimento célula para o eletrodo. O aumento da resistência é directamente próproporcional ao número de células que cruzam o eletrodo 10. A adição de anticorpo monoclonal específico para um quimioatractor ou toxinas conhecidas para interferir com receptores acoplados à proteína G pode bloquear a quimiotaxia 11. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig1.jpg" /> Figura 1. Quimiotaxia de células Jurkat T humanos em resposta a SDF1α. Humanos células Jurkat T (2.0x10 células 6 / ml) foram expostos a um gradiente de SDF-1α (a partir de concentração de 100 ng / ml) ou RPMI 1640 como um controlo negativo. A resistência normalizada em 4000 Hz foi representado graficamente. As células Jurkat T humanos movido em resposta a SDF-1α, como evidenciado pelo aumento da resistência e microtransients, enquanto nenhum movimento foi observado com a exposição ao meio RPMI 1640. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig2.jpg" /> Figura 2. Vista de cima de um ECIS / Táxis Eletrodo without de agarose. Cada eléctrodo ECIS / táxis é composta de 8 câmaras individuais. Cada câmara de partilha um eléctrodo grande (uma), e contém um eléctrodo de alvo individual (b). Cada câmara tem também 2 círculos de ouro (c), que são utilizados como um guia de corte, quando os poços no agarose com as cânulas. Os quadrados de ouro (d) são as almofadas de contacto que se ligam aos pinos pogo a fim de aplicar a corrente de CA para o eléctrodo. Os eléctrodos são, cada um alvo individuais no circuito com eléctrodo maior contador (e). <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig3.jpg" /> Figura 3. Dois poços são cortadas em cada câmara de agarose-preenchidos. Quando o quimioatraente é adicionado a uma bem ele difunde para criar um gradiente na agarose, com a maior concentração de chemoattract mais próximo do quimioatractor bem. As células viajar por baixo da agarose para concentrações mais elevadas de quimioatraente e pode passar sobre o eléctrodo de destino. Comoas células atravessar o eléctrodo de destino, um aumento de resistência é gravado pelo software ECIS 1600R. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig4.jpg" /> Figura 4. A inserção de duas cânulas calibre 14 em plexiglass. A) A B 5/64 &quot;broca é usada para afiar a ponta da cânula.) Dois furos devem ser perfurados em plexiglass para acomodar as cânulas de calibre 14 de acordo com o tiro layout. C) Use uma broca imprensa para garantir que os buracos são perpendiculares para a superfície pleixglass. D) duas cânulas afiada são inseridos através de ¼ &quot;plexiglass, 2 mm de intervalo (medido a partir de arestas interiores). Estes cânulas afiada são cuidadosamente inserido agarose para cortar os poços. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig5.jpg" /> Figura 5. Alinhando cânulas com pontos de ouro em ECIS / Taxis câmara. Para cortar poços, as cânulas afiada deveser alinhados com os pontos de ouro que flanqueiam o eléctrodo de destino no fundo da câmara de ECIS / táxis. A cânula deve ser inserida verticalmente, sem qualquer movimento horizontal, e removido do mesmo modo.

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	<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Lauffenburger, D. A., Tranquillo, R. T., Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+gradients+of+chemotactic+factors+in+chemotaxis+assays.">Concentration gradients of chemotactic factors in chemotaxis assays.</a> Methods Enzymol. 162, 85-101 (1988).</li><li>Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. 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David A Knecht e Michael A Lynes ter uma patente concedida para a tecnologia ECIS / Taxis, o qual foi licenciado pela Universidade de Connecticut para Aplicadas Biofísica, Inc.

Novas características do ensaio ECIS / Taxis incluir a sua capacidade de automatizar a coleta de dados em tempo real como as células respondem ao chemoattractant. Embora a aplicação mais comum desta tecnologia consiste em medir as respostas celulares a gradientes quimiotáticos individuais, ou aos gradientes de compostos de misturas de agonistas e antagonistas de quimiotaxia, a abordagem ECIS / táxis é também susceptível às variações de a estas configurações que podem ser bastante útil no avaliação de ca...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do Reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> ECIS Zθ </td><td> Biofísica Aplicada </td><td></td><td> <a href="http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php">http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php</a> </td></tr><tr><td> ECIS Matriz de </td><td> Biofísica Aplicada </td><td> 8W Quimiotaxia </td><td> <a href="http://www.biophysics.com/cultureware.php">http://www.biophysics.com/cultureware.php</a> </td></tr><tr><td> SeaKem GTG agarose </td><td> Aplicações BioWhittaker Molecular </td><td> 50070 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Cellgro </td><td> 10-040 </td><td></td></tr><tr><td> HyClone soro fetal de bovino </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH300703 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / estreptomicina </td><td> Biomedicals MP </td><td> 1670049 </td><td> A penicilina 5000 UI / ml; Estreptomicina 5 mg / ml </td></tr><tr><td> Tampão HEPES </td><td> Biomedicals MP </td><td> 1688449 </td><td> Solução 1M, grau de cultura de células </td></tr><tr><td> Calibre 14 em aço inoxidável cânula (2) 4 polegadas </td><td> Abastecimento Laboratório Geral </td><td> 5-8365-1 </td><td> Ponto Blunt </td></tr></tbody></table>

measurement of cellular chemotaxis with ecis/taxis

Movimento celular em resposta a estímulos externos é fundamental para muitos processos celulares, incluindo a cicatrização de feridas, inflamação e da resposta à infecção. Um método comum para medir a quimiotaxia é o ensaio de câmara de Boyden, em que as células e quimiotáticas são separados por uma membrana porosa. Como as células migrar através da membrana para o quimioatractor, aderem ao lado de baixo da membrana, ou uma descida para os meios subjacentes, e são subsequentemente corados e visualmente contadas 1. Neste método, as células são expostas a um gradiente de íngreme e transiente quimioatractor, que se pensa ser uma representação pobre de gradientes encontrados em tecidos 2. Outro sistema de ensaio, a sub-agarose quimiotaxia ensaio, 3, 4 do movimento das células através de medidas de um substrato sólido em uma película fina que forma aquosa sob a camada de agarose. O gradiente que se desenvolve no agarose é superficial e é pensado para ser um aplicativoropriate representação de ocorrência natural de gradientes. Quimiotaxia pode ser avaliada por imagem microscópica da distância percorrida. Tanto o ensaio de câmara de Boyden eo ensaio sub-agarose são normalmente configurados como ensaios de ponto de extremidade. O sistema ECIS / Taxis automatizado combina a abordagem sub-agarose com célula-substrato elétrica Impedância Sensing (ECIS) 5, 6. Neste ensaio, os eléctrodos alvo estão localizados em cada um de 8 câmaras. Um grande contra-eléctrodo é executado através de cada uma das câmaras 8 (Figura 2). Cada câmara é cheia com agarose e dois poços pequenos são o corte na agarose em ambos os lados do eléctrodo alvo. Um poço é preenchido com a população de células de teste, enquanto o outro mantém as fontes de quimioatraente difusora (Figura 3). Corrente passada através do sistema pode ser usado para determinar a mudança na resistência que ocorre como células passam sobre o eléctrodo de destino. Células no alvo electrode aumentar a resistência do sistema 6. Além disso, as flutuações rápidas na resistência representam alterações nas interacções de células com a superfície do eléctrodo e são indicativos de curso alterações de forma celulares. O sistema de ECIS / táxis podem medir o movimento da população de células em tempo real ao longo de períodos de tempo prolongados, mas também é suficientemente sensível para detectar a chegada de uma única célula no eléctrodo de destino. Dictyostelium discoidium é conhecido para migrar na presença de um gradiente de folato 7, 8 e da sua resposta quimiotáctica pode ser medido com precisão por ECIS / táxis 9. Quimiotaxia de leucócitos, em resposta a SDF1α e antagonistas de quimiotaxia foi também medido com ECIS / táxis 10, 11. Um exemplo da resposta dos leucócitos a SDF1α é mostrado na Figura 1.

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Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

O sistema ECIS / Taxis é um sistema automatizado, o ensaio em tempo real que mede a quimiotaxia celulares. Neste ensaio, as células se movem por baixo de uma camada de agarose para se chegar a um eléctrodo de destino. Movimento celular é medida pelo aparecimento de resistência a AC 0 actual.

Medição de Quimiotaxia celulares com ECIS / Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

measurement-of-cellular-chemotaxis-with-ecistaxis

Research

JoVE Journal

Biology

14.7K visualizações.  University of Connecticut. O sistema ECIS / Taxis é um sistema automatizado, o ensaio em tempo real que mede a quimiotaxia celulares. Neste ensaio, as células se movem por baixo de uma camada de agarose para se chegar a um eléctrodo de destino. Movimento celular é medida pelo aparecimento de resistência a AC 0 actual.

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Studies of Bacterial Chemotaxis Using Microfluidics - Interview

Estudos de Quimiotaxia bacteriana Usando microfluídica - Entrevista

Biologia

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Um dispositivo micro com padrões Groove para estudar o comportamento celular

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller

Glass microelectrodes (also called pipettes) have been a workhorse of electrophysiology for decades. Today, such pipettes are made from glass capillaries using a programmable puller. Such instruments heat the capillary using either a metal filament or a laser and draw out the glass using gravity, a motor or both. Pipettes for patch-clamp recording are formed using only heat and gravity, while sharp electrodes for intracellular recording use a combination of heat, gravity, and a motor. The procedure used to make intracellular recording pipettes is similar to that used to make injection needles for a variety of applications, including cRNA injection into Xenopus oocytes. In general, capillary glass &lt;1.2 mm in diameter is used to make pipettes for patch clamp recording, while narrower glass is used for intracellular recording (outer diameter = 1.0 mm). For each tool, the puller is programmed slightly differently. This video shows how to make both kinds of recording pipettes using pre-established puller programs.

This video shows how to use a programmable puller to make patch pipettes and sharp electrodes for electrophysiology. The same procedure can be used to make a variety of glass tools, including injection needles.

Tornando-Patch pipetas e Eletrodos Sharp com um extrator programável

Glass microelectrodes (also called pipettes) have been a workhorse of electrophysiology for decades.  Today, such pipettes are made from glass capillaries ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

Identificação de complexos de proteínas com proteômica quantitativa em S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective imaging of fluorescent molecules that are closest to a high refractive index substance such as glass1. In this article, we apply this technique to image exocytosis of synaptic vesicles in retinal bipolar cells isolated from the goldfish retina. These neurons are very suitable for this kind of study due to their large axon terminals. By simultaneously patch clamping the bipolar cells, it is possible to investigate the relationship between pre-synaptic voltage and synaptic release2,3. Synaptic vesicles inside the bipolar cell terminals are loaded with a fluorescent dye (FM 1-43&reg;) by co-puffing the dye and a ringer solution containing a high K+ concentration onto the synaptic terminals. This depolarizes the cells and stimulates endocytosis and consequent dye uptake into the glutamatergic vesicles. After washing the excess dye away for around 30 minutes, cells are ready for being patch clamped and imaged simultaneously with a 488 nm laser. The patch pipette solution contains a rhodamine-based peptide that binds selectively to the synaptic ribbon protein RIBEYE4, thereby labeling ribbons specifically when terminals are imaged with a 561 nm laser. This allows the precise localization of active zones and the separation of synaptic from extra-synaptic events.

In this video, we demonstrate how to label and visualize single synaptic vesicle exocytosis and trafficking in goldfish retinal bipolar cells using total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy.

Exocitose imagem em células da retina com Bipolar Microscopia TIRF

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

Um dispositivo micro para Quantificar Quimiotaxia bacteriana em gradientes de concentração estável

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

Receptor de imagem proteína G-Coupled (GPCR) mediada por eventos de sinalização que Quimiotaxia de Controle de Dictyostelium discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Medição do Tempo de vida em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Imagiologia G protein-coupled receptor mediada por quimiotaxia e seus eventos de sinalização em células de HL60 de Neutrófilos-like

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...