A migração celular coletiva é frequentemente guiada pelo gradiente das moléculas de sinalização. Neste vídeo, demonstramos como quantificar as forças celulares durante a migração coletiva guiada pelo gradiente bioquímico. Então, integramos o chip microfluido com microscopia de tração, então usamos o chip microfluido para gerar gradiente bioquímico, e usamos a microscopia de tração para medir a força celular.
Dr.Hwanseok Jang, um pós-graduado no meu laboratório, vai demonstrar o procedimento. Prepare a solução PDMS misturando o elastômero base e o agente de cura em uma proporção de dez para um. Coloque 15 mililitros do elastômero base em um tubo cônico de 50 mililitros e adicione 1,5 mililitros de agente de cura.
Prepare dois desses tubos. Vórtice a mistura PDMS por cinco minutos antes de centrifugar a 196 tempo g por um minuto para remover bolhas. Para fabricar o estêncil PDMS, despeje aproximadamente um mililitro da mistura PDMS no wafer, evitando regiões com padrão SU-8 para que o PDMS toque o lado dos pilares SU-8, mas não o topo do padrão SU-8.
Coloque o wafer em uma superfície plana por mais de 30 minutos à temperatura ambiente, em seguida, cure o PDMS em um forno seco a 80 graus Celsius por mais de duas horas. Retire cuidadosamente o PDMS do molde SU-8, corte a fina membrana PDMS usando um soco oco de 14 milímetros. Remova a poeira na superfície das peças PDMS usando fita adesiva antes de autoclavar os estêncil PDMS.
Para fabricar o microcanal PDMS, despeje aproximadamente 30 mililitros de mistura PDMS sobre o molde SU-8. Degas por 30 minutos em uma câmara de vácuo, e depois curar o PDMS em um forno seco a 80 graus Celsius por mais de duas horas. Retire cuidadosamente o PDMS do molde SU-8 e corte o PDMS para um tamanho de 24 milímetros por 24 milímetros.
Em cada bloco PDMS, crie uma tomada e três entradas usando um soco de biópsia de um milímetro. Fabricação e silanize lâminas de vidro conforme descrito no protocolo de texto. Cubra a superfície bordada do vidro inferior com 100 microliters da solução bind-silane.
Depois de deixar o vidro em temperatura ambiente por uma hora, enxágue o copo três vezes com água deionizada. Em seguida, deixe o vidro secar à temperatura do ar ambiente ou soprando ar comprimido. Prepare a solução de gel de poliacrilamida conforme descrito no protocolo de texto.
Em seguida, transfira para 10 microliters de solução de gel misto para o microwell retangular e coloque um deslizamento de cobertura circular em cima. Corrija o conjunto de vidro personalizado, solução de gel e deslize de tampa na tampa de uma placa de seis poços com fita adesiva e gire-a. Em seguida, centrífuga por 10 minutos a 96 vezes g para trazer partículas fluorescentes para a camada superior do gel de poliacrilamida.
Retire o conjunto da centrífuga e coloque-o sobre uma superfície plana com o deslizamento da tampa virado para baixo. Depois de 30 minutos, gire o conjunto e coloque-o em uma placa de Petri de 35 milímetros. Encha o prato com dois mililitros de água deionizada.
Usando fórceps, remova suavemente o deslizamento da tampa deslizando-o para um lado. Para codificar o colágeno no gel de poliacrilamida, dissolva um miligrama por mililitro sulfo-SANPAH em um tampão HEPES de 50 milimôlares quentes. Solte 200 microliters da solução na superfície do gel e seja ativado por luz UV por 10 minutos.
Após a ativação uv, enxágue o gel duas vezes com tampão HEPES molar 0,1 e, em seguida, uma vez com PBS. Código o gel de poliacrilamida com solução de colágeno a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, lave o gel três vezes com PBS.
Mergulhe o estêncil PDMS autoclavado na solução F-127. Mantenha-o em uma incubadora Celsius de 37 graus por uma hora. Lave o estêncil PDMS com PBS três vezes e remova o líquido tanto do estêncil PDMS quanto do gel de poliacrilamida.
Em seguida, coloque o estêncil PDMS no gel de poliacrilamida e adicione PBS ao estêncil. Remova bolhas nos orifícios do estêncil PDMS, pipetando suavemente. Depois de remover bolhas, limpe o PBS da superfície do estêncil PDMS.
Agora adicione 200 microliters da solução celular ao estêncil PDMS e coloque o gel em uma incubadora por uma hora para que as células se conectem ao gel de poliacrilamida. Após a incubação, lave suavemente a solução celular com mídia de cultura celular e adicione mais mídia de cultura celular. Remova o estêncil PDMS, verifique a formação de ilhas celulares sob um microscópio.
Em seguida, trate a superfície do microcanal PDMS com plasma de oxigênio por 30 segundos. Depois de remover qualquer fluido no vidro inferior recheado com gel poliacrilamida, coloque o microcanal do PDMS em cima do vidro inferior e coloque o conjunto no suporte de vidro personalizado. Encha o microcanal com meio de cultura celular.
Para preparar a tubulação de entrada do sistema microfluido integrado, conecte uma agulha aparada e uma linha de mini volume de 30 centímetros com uma torneira de três vias. Prepare três desses arranjos. Para tubos de saída, conecte uma agulha aparada e uma linha de mini volume de 75 centímetros com uma torneira de três vias.
Encha as linhas de tubulação com o meio que foi pré-aquecido por uma hora. Prepare os reservatórios removendo os êmbolos das seringas e conectando linhas de tubulação de entrada. Conecte os conectores da agulha de cada linha de tubulação nas três entradas e uma saída do dispositivo microfluido.
Encha cada reservatório com três mililitros de meio fresco ou meio condicionado. Para o teste de gradiente, encha o reservatório de entrada esquerda com 20 nanogramas por fator de crescimento de hepatócito mililitro, ou HGF, no meio de cultura celular. Para visualização do gradiente de concentração, adicione 200 microgramas por mililitro de corante fluorescente ao reservatório de entrada esquerda.
Conecte a linha de tubos de saída a uma bomba de seringa. Coloque o sistema microfluido integrado no estágio de um microscópio epifluorescente convencional. Tire imagens a cada 10 minutos por até 24 horas usando um microscópio automatizado alojado em uma incubadora.
Em cada ponto de tempo, pegue um conjunto de imagens usando uma lente objetiva 4X em três canais diferentes, incluindo uma imagem de fase para visualizar a migração celular, uma imagem fluorescente verde para visualizar contas fluorescentes embutidas no gel, e uma imagem fluorescente vermelha para visualizar o gradiente de concentração de um produto químico. Depois de tirar imagens de lapso de tempo, infundir a solução Trypsin-EDTA de 0,25% em microcanais para separar células do gel de poliacrilamida. Ao remover completamente as células do gel, tome uma imagem fluorescente verde para ser usada como uma imagem de referência para microscopia de tração.
Proceda à análise de dados conforme descrito no protocolo de texto. Para medir a força contratil e o estresse intercelular, a microscopia de tração e a microscopia de estresse da monocamada foram combinadas com o canal microfluido. Os mapas foram traçados em coordenação de rádio com tração externa usando cor morna e tração interior usando cor fria.
No momento zero, todas as ilhas apresentaram distribuições de tração semelhantes com forte tração interna na borda e flutuação dentro da ilha. Após 10 horas de aplicação do gradiente HGF, enquanto o grau de expansão da ilha foi diferente em cada coluna, as distribuições de tração foram em grande parte semelhantes ao tempo zero. A tração média não mudou por 10 horas.
Ao calcular o estresse da monocamada, no entanto, cada coluna mostrou tendências diferentes. Onde a concentração de HGF era baixa, a tensão média dentro das ilhas foi mantida em torno de 200 pascals durante um período de 10 horas. Onde a concentração de HGF era alta, a tensão média dentro das ilhas gradualmente diminuiu de 230 pascals para 100 pascals ao longo de 10 horas, como mostrado anteriormente.
Onde a concentração de HGF era alta na metade esquerda e baixa na metade direita da ilha, a tensão média foi mantida em torno de 150 pascals. O preenchimento do canal microfluido deve ser gentil. É importante remover bolhas presas no canal enquanto simultaneamente não interrompe ilhas de células micro-pais.
Usando este sistema integrado, pode-se investigá-lo como o coletivo celular responde mecanicamente a vários gradientes químicos, como atratores de quimioterapia ou fatores de crescimento. Esta plataforma nos ajudará a explorar ainda mais a mecânica da migração celular coletiva sob gradientes químicos, que é a chave para entender a regeneração, a metástase do câncer e o desenvolvimento.
