Procedimento <ol><li> Lay cabo na almofada limpa e dab off excesso de sangue. Fazer cortes frescos em ambas as extremidades do cabo. </li><li> Inserir 21 1 / 2 G agulha com a bainha da agulha de plástico ON, na veia. (A veia é a maior abertura; os 2 menores são artérias) </li><li> Fixar a agulha no lugar com uma pinça hemostática e anexar a seringa 20cc de Hanks para a agulha. </li><li> Empurre a Hanks através da veia com pressão moderada. Recolher os resíduos no recipiente com água sanitária. (Segurando a agulha e cordão com uma mão enquanto empurrando impediria a agulha pulando para fora da veia.) Se há um monte de sangue na veia, lave pela segunda vez. </li><li> Lay cabo na almofada e prenda a outra extremidade da veia. Preencher com alguns ml de Hanks para verificar vazamentos ao longo da medula. Retirar a 5 mL e desconecte o grampo inferior. </li><li> Desconectar a seringa de 20cc. Retire o êmbolo da seringa 10cc. Anexar seringa 10cc a agulha, despeje 10ml colagenase e substituir êmbolo. Empurre colagenase na veia até ver o primeiro montante sair da extremidade aberta. Re-fixação da extremidade aberta e encha com colagenase até que haja distensão moderada da veia. Demais resultados distensão na contaminação do músculo liso. </li><li> Massagem suavemente o cabo. </li><li> Cabo de incubar (com hemostats agulha e seringa em anexo) em DPBS a 37 ° C por 15 min. </li><li> Durante a incubação, continue os passos 1-8 com 2 nd cabo. </li><li> Após a incubação, tomar cabo de fora do copo e, segurando o cabo de cima do tubo de 50 mL corte a extremidade acima do grampo inferior. Certifique-se de coletar tudo no tubo. Empurre a colagenase restantes através do cordão, em seguida, anexar a seringa 20cc e empurre Hanks completamente com pressão moderada. </li><li> Se não houver células musculares lisas são necessários, descartar o cabo neste momento. Caso contrário, o cabo do mesmo em um tubo de 50 mL em segundo lugar com 5ml ~ colagenase e incubar a 37 ° C por 30-60 min. </li><li> Manter o tubo até que todos os cabos são feitos. </li><li> Girar tubos em ~ 1200 rpm por 5 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante (exceto para ~ mL 1-2). Ressuspender o sedimento em 5mls PHEC + e placa em um T25. </li><li> Incubar a 37 ° C com 5% de CO 2 durante a noite. </li><li> No dia seguinte remova o sobrenadante e substituir com a mídia fresco. Se houver muitas hemácias, lave uma vez com M199, em seguida, adicione + PHEC. Continue incubação, como de costume até que a placa é confluente (1-4 dias). Dividida em uma T75 gelatinizado. </li><li> Uma vez T75 é confluente, dividida em três T75s. Congelar dois frascos por frasco. </li></ol> Nota: As células endoteliais (unactivated) têm uma aparência de paralelepípedo. Células endoteliais são ativados por vezes (longo e pontudo), logo após o isolamento, depois de alguns passes que eles geralmente voltam para um estado unactive. Limpeza <ol><li> Com muito cuidado, descarte de agulhas em recipiente adequado. </li><li> Dispor de seringas em recipiente biohazard grande. </li><li> Colocar todo o tecido em saco biohazard pequeno. Saco de fechar e congelar a -20 ° até a incineração. </li><li> Mergulhe todos os instrumentos em virucide por pelo menos 10 min. </li><li> Adicionar meio de incubação para resíduos copo / água sanitária. Deixe descansar por pelo menos 10 min. </li><li> Descarte as pastilhas de bancada para resíduos de risco biológico. </li><li> Spray para baixo o interior eo exterior de copos, bancada de trabalho e do banho de água com tampa vircide. Deixe descansar 10 min, em seguida, limpe. </li><li> Enxágüe copos e instrumentos com água morna e pendurar na cremalheira para secar (blot fora os instrumentos para que eles não ferrugem). </li><li> Descarte de resíduos descontaminados na pia. </li><li> Retorno de mídia não utilizados para geladeira. </li><li> Dispor de luvas em resíduos de risco biológico. </li></ol>

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>0.1% Collagenase </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>10ml per cord, warmed to 37&#176;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Tissue culture flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>T75, one per cord.</td>
</tr>
<tr>
<td>Hanks medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>beaker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>50 ml tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation of human umbilical vein endothelial cells (huvec)

A angiogênese é um processo de várias etapas complexas, onde, em resposta a estímulos angiogênicos, novos vasos são criados a partir da vasculatura existente. Estes passos incluem: degradação da membrana basal a proliferação e migração (sprouting) das células endoteliais (CE) na matriz extracelular, o alinhamento da CE em cordas, formação de lúmen, a anastomose, e formação de uma nova membrana basal. Muitos ensaios in vitro têm sido desenvolvidos para estudar este processo, mas a maioria apenas imitar determinadas fases da angiogênese, e morfologicamente os vasos muitas vezes não se assemelham a vasos in vivo. Aqui demonstramos um otimizado ensaio in vitro que utiliza a angiogênese umbilical humano veia CE e fibroblastos. Este modelo recapitula todas as etapas chave no início da angiogênese, e mais importante dos vasos mostrar lumens patente intercelular cercado por CE polarizada. Vasos podem ser facilmente observados por contraste de fase e microscopia de lapso de tempo, e recuperados em forma pura para aplicações a jusante.

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Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

Este protocolo de vídeo ilustra o isolamento e cultura de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) de cordão umbilical humano. Uma vez isolados essas células podem ser usadas em ensaios de angiogênese in vitro como o Gel de fibrina Optimized Bead Assay também demonstrada pelo laboratório Hughes.

Isolamento de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

31.3K visualizações.  University of California, Irvine (UCI). Este protocolo de vídeo ilustra o isolamento e cultura de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) de cordão umbilical humano. Uma vez isolados essas células podem ser usadas em ensaios de angiogênese in vitro como o Gel de fibrina Optimized Bead Assay também demonstrada pelo laboratório Hughes.