Agradecemos ao Dr. Pina Colarusso eo Mecanismo de imagens de células vivas para sua colaboração com a imagem e análise de imagem; Ms. Lailey por sua assistência técnica; e unidade 51 no Hospital Foothills, em Calgary, AB pela prestação de cordões umbilicais humanos. Dr. KD Patel é um Inova Alberta: Saúde Scientist Solutions. Este trabalho foi financiado por uma subvenção de funcionamento do Canadian Institutes for Health Research e doações de equipamentos e infra-estrutura da Fundação Canadense para Inovação e da Ciência e da Autoridade de Alberta Research.

1. Isolamento e Manutenção de Humanos As células endoteliais vasculares <ol><li> Nível 2 procedimentos de biossegurança devem ser usados ​​quando se trabalha com sangue humano e do tecido. Usando uma tesoura cortar o cordão da placenta e, em seguida, analisar atentamente o cabo de coágulos sanguíneos e danos causados ​​por clampeamento do cordão durante o parto. Recorte e descartar essas porções do cordão umbilical. </li><li> Preparar solução de colagenase fresco a 1 mg / ml por vazamento 50 ml de tampão de cordão quente em um tubo que contém 50 mg de colagenase. </li><li> Mude para uso de luvas estéreis e abrir uma bandeja de instrumentos esterilizados em autoclave contendo cânulas grossas, pinças, tesouras, cabo de três vias de galos e gaze em uma capela de fluxo laminar. </li><li> Identifique as duas artérias e do presente única veia no cordão umbilical. As artérias são menores e tendem a ser firmemente apertada, enquanto que a veia é grande e de fácil utilização para canular. Para liberar o sangue da veia, gentilmente inserir uma cânula com uma torneira de duas vias ligado a ele into uma extremidade da veia e lugar uma braçadeira em torno da cânula para segurá-la firmemente em posição. Perfundir tampão cabo através da veia. Repita até que o fluxo através é clara e, em seguida, fixar a extremidade do cordão umbilical. </li><li> Colagenase perfundir na veia, fechar a torneira, colocar o cabo a um copo contendo tampão de cordão quente e incubar durante 10 minutos. Após 10 minutos, retire o cabo e massageie suavemente o cabo para soltar as células endoteliais a partir do lúmen da veia. Drenar a solução para dentro do tubo contendo meios de células endoteliais (ECM). Lavar com tampão de cabo de duas vezes para remover as células restantes. Drenar a solução para o mesmo tubo. </li><li> Centrifugar as células a 350 xg durante 10 minutos para sedimentar as células endoteliais. </li><li> Remover o sobrenadante e adicionar 10 ml de ECM para o sedimento. Suavemente ressuspender as células em ECM, em seguida, transferir as células para um balão T75 pré-revestida com 0,2% de gelatina. Pré-revestimento com gelatina foi feito durante pelo menos 1 hora a 37 ° C. Crescer as células a 37 ° C e 5% De CO 2. </li><li> No dia seguinte, agitar suavemente o frasco para desalojar quaisquer células vermelhas do sangue, em seguida, remover o sobrenadante e lava-se com solução de Hank quente de sal equilibrada (HBSS). Remover HBSS e alimentar as células com 10 ml de ECM quente. Examinar as células ao microscópio para assegurar que as células vermelhas do sangue foram removidas. Avaliar o grau de confluência e morfologia das células endoteliais. As células endoteliais nesta fase deve ser alongada sem nenhum sinal de vacúolos. </li><li> Continuam a mudar os meios de comunicação de três em três dias até atingir confluência, as células de células, em seguida, dividido usando uma solução 0,08% de tripsina contendo 1 mM de EDTA. As células endoteliais da placa em pratos desejados pré-revestida com 0,2% de gelatina. As células devem atingir confluência em 3-6 dias. </li><li> Ao utilizar ibidi câmaras, revestimento pré-cada câmara com 0,2% de gelatina. Remover o excesso de gelatina e fibronectina e, em seguida adicionar 1,5 X 10 6 / ml de células endoteliais em suspensão em ECM para dentro da câmara. Troque a mídia todos os dias até confluent. As células devem ser confluentes em 2-3 dias, dependendo do cabo. </li></ol> 2. Preparação de Neutrófilos <ol><li> Os neutrófilos foram isolados a partir do sangue periférico de voluntários humanos saudáveis, utilizando centrifugação de densidade. Um protocolo detalhado com uma demonstração visual para o isolamento dos neutrófilos pode ser encontrada na edição anterior deste periódico 6. Uma vez isolados, os neutrófilos Ressuspenda a uma concentração de 1x10 6 / ml em HBSS contendo 0,5% de albumina humana. </li></ol> 3. Configurando a Câmara Ibidi <ol><li> Crescer as células endoteliais em uma câmara de ibidi gelatina-revestido. Examiná-los todos os dias usando microscopia de contraste de fase até que se tornem bem confluentes. </li><li> Estimular as células endoteliais para aumentar a expressão de moléculas de adesão e de activação. Para os fins deste protocolo, as células endoteliais foram estimuladas com 10 ng / mL de recombinante de TNF-α durante quatro horas a 37 ° C e 5% CO <sub&gt; 2 antes da criação da câmara ibidi para imagens em condições de escoamento. </li><li> Preparar o microscópio, e bomba de seringa como descrito por visualmente Wiese e colegas 11 utilizando uma câmara de ibidi vazio. </li><li> As principais diferenças entre este protocolo eo procedimento Wiese incluem pré-enchimento do tubo para evitar a exposição das células endoteliais para a atmosfera, mantendo o tampão a 37 ° C utilizando um banho de água, utilizando tubagem PharMed para manter o tampão de perder temperatura e utilizando diferentes objectivos sobre o microscópio, dependendo se de imagem com contraste de fase ou de fluorescência. </li><li> Uma vez que o microscópio está configurado eo tubo é preenchido com HBSS, feche todas as torneiras e retire a câmara ibidi vazio. </li><li> Ligar a câmara de ibidi contendo o TNF-α estimulada células endoteliais para a tubagem. </li></ol> 4. Recrutamento de neutrófilos e Transmigração <ol><li> Visualize a monocamada de células endoteliais no MicroscOpe usando um objectivo contraste 10x fase. </li><li> Ajustar a bomba seringa para retirar e começar o fluxo de HBSS na tensão de cisalhamento desejada (normalmente entre 0,5-2 dines / cm 2). </li><li> No lado de entrada de chave, a partir de HBSS a neutrófilos isolados (1x10 6 / mL), rodando a forma de três paradas galo. </li><li> Começar a gravar com uma câmera CCD ligados a um gravador de DVD ou conectado diretamente ao computador. Inicie o temporizador quando neutrófilos entrar na câmara. Perfundir neutrófilos para quatro minutos. Um total de 3 mL da suspensão de neutrófilos é suficiente para uma única experiência. </li><li> Depois de quatro minutos, voltar a HBSS para evitar a fixação de novos neutrófilos. Se os dados de interações totais, rolamento e adesão firme são desejados, imagem 6 campos aleatórios por 10 segundos cada uma usando uma objetiva 10x contraste de fase entre 4 e 5 minutos. </li><li> Mudar para uma objetiva de 40x e gravar um único campo de visão entre 5 e 10 minutos. Aos 10 minutos, recolherentre 5 e 10 campos aleatórios de vista. </li><li> Parar o fluxo e passar para próxima câmara. </li></ol> 5. Imagem fluorescente sob condições de fluxo utilizando uma câmara de Ibidi <ol><li> Células endoteliais ou etiqueta ou neutrófilos com uma sonda fluorescente de interesse. Por exemplo, um anticorpo anti-VE caderina conjugada com Alexa-[547] pode ser usado para visualizar junções celulares endoteliais. </li><li> Montar câmara ibidi num microscópio de contraste de interferência diferencial (DIC) e capacidades fluorescentes. Usamos um FluoView 1000 confocal (Olympus) com uma câmara ambiental. Concentre-se usando um objetivo projetado para o trabalho DIC e fluorescentes. </li><li> Adquirir imagens simultâneas DIC e fluorescente usando o software fornecido pelo vendedor, enquanto seguindo o curso do tempo descrito na seção 4. </li></ol> 6. Análise de recrutamento dos neutrófilos <ol><li> Análise de laminagem e interagindo células é descrita por Wiese et al 11. </li&gt; <li> Para medir a percentagem de neutrófilos de rolamento sobre a monocamada endotelial contar o número de neutrófilos que se moveram mais do que um diâmetro da célula em um período de 5 segundos. Dividir este número pelo número total de leucócitos no campo para determinar a percentagem de células de rolamento. Por extensão, as células restantes são considerados firmemente aderente. </li><li> Medir a velocidade de rolamento de neutrófilos através do cálculo da distância percorrida a neutrófilos em um determinado período de tempo e, em seguida, dividindo-o pelo que o tempo em segundos. </li><li> Transmigração é determinada pela contagem do número de neutrófilos que foram alterados de forma e migrou sob a monocamada 10. Estes neutrófilos são identificados pelo facto de eles mudar de ser fase brilhante quando no topo da monocamada de ser escuro fase quando debaixo da monocamada 10. O número de células transmigradas pode ser expresso como uma percentagem do total de células no campo de visão ou como um dormente brutoer de células transmigradas por unidade de área. Neste sistema de modelo, tipicamente 50% de neutrófilos transmigrar após 10 minutos. </li></ol> 7. Os resultados representativos Não estimuladas as células endoteliais não suportam o recrutamento de neutrófilos. Em contraste, estimulando as células endoteliais com TNF-a resultados em neutrófilos de rolamento, adesão firme e transmigração. Um exemplo destes dados é mostrado nas Figuras 1 e 2. A Figura 1A mostra neutrófilos que interagem com o TNF-α-estimuladas células endoteliais. Estas interacções podem ser quantificados, revelando o número total de neutrófilos que interagem com as células endoteliais, bem como o número de neutrófilos de rolamento, firmemente aderente ou transmigrou (Figura 2). Transmigração de neutrófilos pode ocorrer em junções celulares ou através das células endoteliais em si. Para diferenciar entre estas duas condições, as células endoteliais são rotulados com um anti-VE-c<html> adherin anticorpo e transmigração é pontuada como ocorrendo paracellularly ou transcellularly (Figura 1B e C). Neste modelo, virtualmente toda a transmigração é paracelular 7. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4032/4032fig1.jpg" /> Figura 1. DIC simultânea e imagens de fluorescência sob condições de fluxo utilizando uma câmara de ibidi. (A) imagem DIC recém isolado neutrófilos humanos que migram através de células endoteliais da veia umbilical humana. A seta amarela mostra um adepto de neutrófilos, a seta branca mostra uma neutrófilos transmigrando. (B) junções celulares endoteliais foram coradas com um anticorpo anti-VE caderina conjugada com Alexa-[547] e imagens. (C) mostra overlay do canal A e B revela que praticamente transmigrando tudo neste modelo é paracelular. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4032/4032fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . _content &quot;&gt; <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4032/4032fig2.jpg" /> Figura 2. As células endoteliais foram deixados não estimulada ou foram estimulados com 10 ng / mL de TNF-α. Após 4 horas, uma câmara de fluxo paralelo placa foi montado e neutrófilos foram perfundidos através de um dines / cm 2. (A) interacções neutrófilos foram examinados e medida utilizando software ImageJ de NIH. As células interagindo totais foram caracterizadas como (B) de rolamento, firmemente aderente ou (C) transmigrando. Os dados representam a média + SEM de entre 3 e 5 experiências. A diferença entre controle e TNF em painéis A e C foi significativa (p &lt;0,001).

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	<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).</li><li>Diacovo, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+rolling,+arrest,+and+transmigration+across+activated,+surface-adherent+platelets+via+sequential+action+of+P-selectin+and+the+beta+2-integrin+CD11b/CD18.">Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-adherent platelets via sequential action of P-selectin and the beta 2-integrin CD11b/CD18.</a> Blood. 88, 146-157 (1996).</li><li>Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Petri, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+LSP1+is+involved+in+endothelial+dome+formation,+minimizing+vascular+permeability+changes+during+neutrophil+transmigration+in+vivo.">Endothelial LSP1 is involved in endothelial dome formation, minimizing vascular permeability changes during neutrophil transmigration in vivo.</a> Blood. 117, 942-952 (2011).</li><li>Chavakis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+junctional+adhesion+molecule-C+promotes+neutrophil+transendothelial+migration+in+vitro+and+in+vivo.">The junctional adhesion molecule-C promotes neutrophil transendothelial migration in vitro and in vivo.</a> J. Biol. Chem. 279, 55602-55608 (2004).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Isolation+Protocol.">Neutrophil Isolation Protocol.</a> J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).</li><li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+leukocyte+transmigration:+cell+surface+interactions+and+signaling+events.">Regulation of leukocyte transmigration: cell surface interactions and signaling events.</a> J. Immunol. 172, 7-13 (2004).</li><li>Alcaide, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+under+shear+flow:+it's+all+about+endothelial+cell+rings+and+gaps.">Neutrophil recruitment under shear flow: it's all about endothelial cell rings and gaps.</a> Microcirculation. 16, 43-57 (2009).</li><li>Jutila, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+neutrophil+adhesion+under+conditions+mimicking+blood+flow.">Measurement of neutrophil adhesion under conditions mimicking blood flow.</a> Neutrophil Methods and Protocols. 412, 239-256 (2007).</li><li>Cuvelier, S. L., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+leukocyte+rolling+and+adhesion+in+vitro+under+flow+conditions.">Studying leukocyte rolling and adhesion in vitro under flow conditions.</a> Basic Cell Culture Protocols. 290, 331-342 (2005).</li><li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Physiologic+E-Selectin-Mediated+Leukocyte+Rolling+on+Microvascular+Endothelium.">Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium.</a> J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).</li><li>Petzelbauer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+dermal+microvascular+endothelial+cell+antigen+expression+and+cytokine+responsiveness+in+situ+and+in+cell+culture.">Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture.</a> J. Immunol. 151, 5062-5072 (1993).</li><li>Bonder, C. S., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+leukocyte+recruitment+to+splanchnic+organs+to+reduce+inflammation.">Modulating leukocyte recruitment to splanchnic organs to reduce inflammation.</a> Am J Phys - Gastrointestinal and Liver Phys. 284, G729-G733 (2003).</li><li>Cuvelier, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eosinophil+adhesion+under+flow+conditions+activates+mechanosensitive+signaling+pathways+in+human+endothelial+cells.">Eosinophil adhesion under flow conditions activates mechanosensitive signaling pathways in human endothelial cells.</a> J. Exp. Med. 202, 865-876 (2005).</li><li>Massia, S. P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+endothelial+cell+interactions+with+surface-coupled+adhesion+peptides+on+a+nonadhesive+glass+substrate+and+two+polymeric+biomaterials.">Human endothelial cell interactions with surface-coupled adhesion peptides on a nonadhesive glass substrate and two polymeric biomaterials.</a> J. Biomed. Mat. Res. 25, 223-242 (1991).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

<html> Os pesquisadores têm utilizado rotineiramente células endoteliais de diversos leitos vasculares para estudar o recrutamento de neutrófilos e transmigração. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a, células endoteliais microvasculares dérmicas 12, fígado sinusoidais células endoteliais 13 e células endoteliais da veia umbilical humana 10. Entre eles HUVEC ganharam popularidade devido à sua largura relativa facilidade de isolamento e de disponibilidade. HUVEC são ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente e Equipamentos </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Colagenase tipo 1 </td><td> Worthington </td><td> 4197 </td><td></td></tr><tr><td> Tampão cabo </td><td></td><td></td><td> Composição: 140 mM de NaCl 4 mM de KCl 10 mM D-glucose em 1 mM de NaH 2 PO 4 / Na 2 HPO 4 tampão a pH 7,4 </td></tr><tr><td> Endoteliais mídia celular (ECM) </td><td></td><td></td><td> M199 com sais de águia suplementado com 16% de soro humano contendo 100 unidades de penicilina 100 ug de estreptomicina e 0,3 mg de L-glutamine/ml </td></tr><tr><td> M199 </td><td> GIBCO </td><td> 31100-035 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina glutamato estreptomicina (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 10378-016 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Ibidi câmaras </td><td> Ibidi </td><td> 80606 </td><td></td></tr><tr><td> TNF-α </td><td> Prepro Tecnologia </td><td> 300-01A </td><td></td></tr><tr><td> Solução de albumina humana a 20% </td><td> Bioproducts Gêmeos </td><td> 800120050 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS sem Ca 2 + e Mg 2 + </td><td> Sigma </td><td> H2487-10X </td><td></td></tr><tr><td> HBSS com Ca2 + e Mg2 + </td><td> Sigma </td><td> H1387-10X </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions

Os neutrófilos são o tipo mais abundante de células brancas do sangue. Eles formam uma parte essencial do sistema imune inato 1. Durante a inflamação aguda, os neutrófilos são as primeiras células inflamatórias para migrar para o local da lesão. Recrutamento dos neutrófilos para um local da lesão é um processo gradual que inclui a dilatação, primeiro de vasos sanguíneos para aumentar o fluxo sanguíneo; segundo, microvasculares alterações estruturais e escapar de proteínas do plasma a partir da corrente sanguínea, o terceiro, aderência, laminagem e transmigração de neutrófilos através do endotélio; e quarta acumulação de neutrófilos no local da lesão 2,3. Uma vasta gama de in vivo e in vitro evoluiu para permitir o estudo destas 4 processos. Este método enfoca a transmigração de neutrófilos através de células endoteliais humanas. Um método popular para examinar os processos moleculares envolvidos na transmigração de neutrófilos utiliza n humanoeutrophils interagindo com primários células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) 5. Isolamento dos neutrófilos tem sido descrito em outro lugar visualmente 6; assim, este artigo vai mostrar o método para o isolamento de HUVEC. Uma vez isolado e crescidas até à confluência, as células endoteliais são activados resultando na regulação positiva de moléculas de adesão e de activação. Por exemplo, a activação das células endoteliais com citoquinas como TNF-a resulta em aumento E-selectina e IL-8 expressão 7. E-selectina medeia de captura e de rolamento de neutrófilos e IL-8 de activação e medeia a adesão firme dos neutrófilos. Depois de neutrófilos adesão transmigrar. Transmigração pode ocorrer paracellularly (através de junções de células endoteliais) ou transcellularly (através da célula endotelial em si). Na maioria dos casos, estas interacções ocorrer sob condições de fluxo encontrados na vasculatura 7,8. A câmara de fluxo de placas paralelas é um sistema muito usado que mimicrofones o cisalhamento hidrodinâmico tensões encontrado in vivo e permite o estudo do recrutamento dos neutrófilos sob condição de fluxo in vitro 9,10. Várias empresas produzem câmaras de fluxo de placas paralelas e cada um tem vantagens e desvantagens. Se fluorescente de imagem é necessário, de vidro ou um polímero opticamente semelhante precisa de ser utilizado. As células endoteliais não crescem bem em vidro. Apresentamos aqui um método fácil e rápido para a imagiologia de contraste de fase, DIC e fluorescentes de transmigração de neutrófilos utilizando um baixo volume de corrediça canal ibidi feito de um polímero que suporta a adesão rápida e crescimento de células endoteliais humanas e tem qualidades ópticas que são comparáveis ​​aos vidro. Neste método, as células endoteliais foram cultivadas e estimuladas em um μslide ibidi. Os neutrófilos foram introduzidos sob condições de escoamento e transmigração foi avaliada. Imagem fluorescente das junções activado em tempo real determinação da extensão de paracelular contratransmigração transcelular.

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Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Este artigo primeiro descreve um procedimento para isolar células endoteliais humanas a partir de veias umbilicais e, em seguida, mostra como usar estas células para examinar transmigração de neutrófilos em condições de escoamento. Ao utilizar uma câmara de fluxo de baixo volume feita a partir de um polímero com as características ópticas do vidro, ao vivo de células imagem fluorescente de populações de células raras é também possível.

Isolamento de Células endoteliais da veia umbilical humana e sua utilização no estudo de transmigração de Neutrófilos sob condições de fluxo

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

isolation-human-umbilical-vein-endothelial-cells-their-use-study

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.0K visualizações.  University of Calgary. Este artigo primeiro descreve um procedimento para isolar células endoteliais humanas a partir de veias umbilicais e, em seguida, mostra como usar estas células para examinar transmigração de neutrófilos em condições de escoamento. Ao utilizar uma câmara de fluxo de baixo volume feita a partir de um polímero com as características ópticas do vidro, ao vivo de células imagem fluorescente de populações de células raras é também possível.

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Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensaio medir a adesão de neutrófilos ativados primárias células humanas endoteliais microvasculares em condições estáticas

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Imunologia e Infecção

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Um fluxo de Adesão Ensaio para o Estudo de Recrutamento de leucócitos para hepáticas humanas senoidais endotélio sob condições de estresse de cisalhamento

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

Fluxo de Neutrófilos Humanos Secção Ensaio de Adesão

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

Imagens em tempo real de endoteliais junções célula-célula durante Neutrophil Transmigração Sob Fisiológica Fluxo

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In Vitro e In Vivo modelo para estudar a adesão bacteriana para o Vaso de parede em condições de escoamento

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

A citometria de fluxo para avaliar o estado de cromatina em células T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Isolamento de neutrófilos e análise para determinar seu papel na linfoma sensibilidade das células a agentes terapêuticos

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolamento e cultura In Vitro de macrófagos alveolares murino e humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

Estudo simultâneo do recrutamento de monócitos subpopulações sob fluxo In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Preparação de medula óssea inteira para análise de citometria de massa de células de linhagem de neutrófilos

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...