O trabalho foi suportado em parte pelo National Institute of Health (R01GM079688, R21RR024439 e R21GM075838), National Science Foundation (CBET 0.941.055), ea Fundação MSU.

1. Isolamento de CTMs Rat Células-tronco mesenquimais foram isoladas 6-8 semanas de ratos Sprague-Dawley, sexo feminino, como descrito anteriormente 1, 2. MSCs isoladas podem aderir à superfície de plástico e facilmente expandir durante a cultura in vitro. <ol><li> O animal foi colocado em uma câmara de anestesia e anestesiados por cerca de cinco minutos. Durante a anestesia, observe a taxa de respiração, piscando e atividade motora. Remover o animal da câmara, imediatamente após parar a atividade motora ea taxa de piscar se tornou freqüente. </li><li> Lay o animal para baixo em uma estação de operação e matar o animal por deslocamento cervical. Cortar o fémur ea tíbia de membros de volta, retire a pele e os músculos. </li><li> Coloque os fêmures dissecados ea tíbia em 70% isopropanol por alguns segundos e transferência para 1X D-PBS. </li><li> Em um armário de biossegurança, o fémur ea tíbia foram transferidos para um prato de 10 centímetros contendo DMEM. Cada osso foi então realizada com pinças e as duas extremidades foram cortadas aberto com uma tesoura. Coloque uma agulha 22G a uma seringa de 3 ml e preenchê-lo com DMEM e então dê descarga da medula em um tubo de 50ml, inserindo a agulha de uma extremidade aberta do osso. Repetir 2 a 3 vezes para cada osso. Quando todas as abóboras foram obtidos, ressuspender as células e passar a suspensão de células através de um filtro de células 70μm para remover os escombros dos ossos e agregados sangue. </li><li> Spin down células em 200g, 4 ° C por 5 minutos e retire o sobrenadante por aspiração. Ressuspender as células em 25ml médio MSC (DMEM contendo 10% FBS e 1% Pen-Strep). 10ml de suspensão celular foi semeado em cada placa de cultura 10 centímetros para um total de dois pratos. Manter os pratos da cultura em 37 ° C e 5% incubadora de CO 2 para 1 a 2 semanas. Meio foi trocado a cada 2 a 3 dias. </li></ol> 2. Enriquecimento de Rat MSCs Uma série de proteínas de superfície foram utilizados para enriquecer MSCs, incluindo CD54, CD90, CD73, CD105 e CD271 3-5. Em nosso estudo, usamos CD54 e CD90 como marcadores para enriquecer MSCs por separação de células magnéticas. <ol><li> Quando as células atingiram cerca de 80% confluência, aspirar o médio e adicione 4 ~ 5 ml de tripsina-EDTA para cada prato. Coloque os pratos de volta para a incubadora e incubar por cerca de 5 minutos para permitir que o desapego celular. Uma vez que as células foram destacadas, adicionar igual quantidade de meio de cultura para inativar a tripsina. Coletar suspensão de células em um tubo de 15ml e células spin down em 200g, 4 ° C por 5 minutos. </li><li> Os próximos passos descrevem como enriquecer MSCs por dois marcadores de superfície CD54 e CD90 de acordo com o manual para separação de células usando BD IMagnet. Pellet celular foi ressuspenso em tampão de coloração de células (3% de calor FBS inativada em 1X D-PBS) a 20 milhões de células / ml. Anticorpos CD54 biotinilado (0.25μg por milhão de células) e de anticorpos CD90 biotinilado (0.15μg por milhão de células) foi adicionado e misturado levemente com a suspensão de células. Após a incubação em gelo por 15 minutos, células marcadas foram lavados com um volume acima de 1X tampão Imag BD. As células marcadas foram girados para baixo em 200g, 4 ° C por 5 minutos. </li><li> Vortex da BD partículas Imag estreptavidina bem, junta-partículas 40μl para cada 10 milhões de células. Mix da partícula com as células marcadas bem e incubar as células em 6 ~ 12 ° C por 30 minutos. Isto permite que as partículas de estreptavidina para vincular ao biotinilado anti-CD54 e anti-CD90, que é ligado às proteínas de superfície CD54 e CD90, respectivamente. </li><li> Durante o tempo de incubação, rotular um tubo de ensaio de fundo redondo para coletar a fração positiva. Após a incubação, reduzir o volume de rotulagem para 20 milhões de células / ml com tampão 1X Imag BD e transferência de células marcadas para o tubo de coleta fração positiva. Coloque o tubo a fração positiva para o IMagnet BD e deixe ficar durante 6 minutos, em seguida, remover o sobrenadante com uma pipeta Pasteur de vidro com tubo a fração positiva ainda na IMagnet BD. </li><li> Retire o tubo fração positiva do IMagnet BD e colocá-lo no gelo. Adicionar 1 ml gelada 1X tampão BD Imag e células ressuspender pela mistura suave. Colocar o tubo de volta para o IMagnet BD e deixá-lo ficar para 2 a 4 minutos. Remover o sobrenadante com uma pipeta Pasteur de vidro novo. Repita a lavagem como descrito em 2.5 mais uma vez. </li><li> Remova o tubo do IMagnet BD e células ressuspender em meio de cultura, uma semente 75 centímetros 2 recipiente para manter as células e um prato de 10 centímetros de citometria de fluxo. </li></ol> 3. Verificação de Expressão marcador de superfície por citometria de fluxo Citometria de fluxo foi realizada para verificar as células obtivemos expressar CD54 e CD90. O HSC marcador CD45 foi usada para confirmar que as CTMs foram esgotados de HSCs. <ol><li> Quando as células se tornam confluentes ~ 80%, trypsinize células com tripsina-EDTA e recolher as células em um tubo de 15ml. Centrifugar a 200 g, 4 ° C por 5 minutos para coletar as células. </li><li> Aspirar o sobrenadante e foih com células 1X D-PBS uma vez. Ressuspender as células em tampão de coloração celular (1X D-PBS contendo 2% de SFB e azida sódica 0,05%) para uma concentração final de 5 ~ 10 milhões de células / ml e manter as células no gelo. Alíquota de 100μl suspensão de células em seis tubos rotulados (1 apenas as células; 2. Isotipo IgG2a controle;.. 3 para controlo do isotipo IgG1, 4 CD45; 5. CD54;.. 6 CD90). </li><li> Adicionar controles isotipo e anticorpos primários em concentrações apropriadas (IgG2a e IgG1: 20μl por milhão de células, CD45: 0.5μg por milhão de células, CD54: 0.25μg por milhão de células, CD90: 0.15μg por milhão de células) e incubar a 4 ° C para 30 minutos. </li><li> Lavar as células com 1X D-PBS duas vezes e, em seguida, as células ressuspender em tampão 100μl de células coloração. Adicionar SA-PE (estreptavidina-ficoeritrina, use 0.15μg por milhão de células) e incubar a 4 ° C por 30 minutos no escuro. </li><li> Lave as células marcadas com 1X D-PBS duas vezes. Ressuspender as células em tampão 400μl de células de coloração e transferir para um tubo falcon para análise de citometria de fluxo. </li></ol> 4. Separação da colônia Único Derivado MSCs MSCs é uma população heterogênea composta por diferentes subpopulações de células com formato diferente, a taxa de crescimento, bem como capacidade de diferenciação 6. No entanto, todas as sub-populações de expressar os marcadores MSC conhecida e, portanto, não é viável a utilização de marcadores para separar estas subpopulações. Por isso, aplicou-se cilindros de clonagem para separar os diferentes subpopulações, que são colônias formadas por células individuais. <ol><li> Células placa em cerca de 50 ~ 100 células por prato de 10cm. Incubar a 37 ° C e 5% incubadora de CO 2 para 1 a 2 semanas. Durante este período, examine colônias bem isoladas com um microscópio invertido. Uma vez que as colônias tenham atingido o tamanho suficientemente grande (melhor mais de 100 células em cada colônia), marca as colônias com uma sharpie no fundo do prato. Quando escolher a colônia a ser marcado, certifique-se que não há colônias vizinhas perto o escolhido. </li><li> Aspirar médio e lave o prato uma vez com 1X D-PBS. Pegue um cilindro clonagem estéril com uma pinça estéril e delicadamente colocá-lo em torno da colônia marcada. Repita este procedimento até todas as colônias marcado tem um cilindro colocado sobre clonagem. As colônias escolhidas devem ser longe uns dos outros, tais que cada cilindro clonagem contém apenas uma colônia. </li><li> Adicionar 100μl de tripsina-EDTA para cada cilindro de clonagem e colocar o prato de volta para a incubadora de ~ 5 minutos. Após 5 minutos, verifique as células ao microscópio para ver se eles estão de arredondamento para cima. Quando as células têm levantado, adicionar igual quantidade de meio de cultura para inativar a tripsina. Misture a suspensão celular com uma micropipeta 200μl e transferir a suspensão celular a um prato 60 milímetros contendo 3ml meio de cultura pré-aquecido. Rotular os pratos corretamente e colocá-los de volta para a incubadora. Controle de alterações morfológicas sobre os próximos dias. </li></ol> 5. Resultados representante De acordo com o protocolo descrito na parte de rato isolamento MSCs, plástico MSCs aderente deve ser visível no dia seguinte após o plaqueamento. Como as células continuam a proliferar as células confluentes deve se parecer com as células mostrado na Figura 1A. Quando as células atingem a 80% confluência (Figura 1B), subcultura pode ser realizada. Durante a subcultura, tripsina-EDTA foi usado para separar as células e células levantou são pequenos e redondos, como mostrado na Figura 1C. <img src="/files/ftp_upload/1852/1852fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Imagens de contraste de fase de rato MSCs. (A) Confluent MSCs. A maioria das células são fusiformes ou estrela-like. (B) MSCs cerca de 80% confluência. (C) células Lifted após tripsinização são pequenas e redondas. Uma vez que as CTMs são enriquecidos por separação de células magnética, análise de citometria de fluxo é realizada para verificar as expressões marcador de superfície. Se o enriquecimento é bom, as células devem mostrar coloração positiva contra os marcadores CD54 e CD90 MSC, mas negativa contra o marcador CD45 HSC (Figura 2). Isotipo IgG2a e IgG1 controles são utilizados como controles negativos. <img src="/files/ftp_upload/1852/1852fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Análise de citometria de fluxo de MSCs de marcadores de superfície. MSCs foram marcadas com anticorpos contra IgG2a (isotipo controle 1), IgG1 (isotipo controle 2), CD45, CD54 e CD90. MSCs expressa CD54 e CD90, mas não CD45. Quando as células são semeadas em densidade adequada clonal, as colônias devem subir a partir de células individuais. Figura 3A representa uma colônia formada por uma única célula. Cilindros de clonagem pode ser usado para separar as colônias e células derivadas das colônias podem ser cultivadas separadamente. Figura 3B e 3C representa células derivadas de duas colônias individual. A colônia de células derivadas de um eixo como são (Figura 3B), enquanto que as células derivadas de colônia dois são redondos (Figura 3C). <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/1852/1852fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Formação de colônias e colônia de CTMs-single células derivadas. MSCs cultivadas em clonal densidade de colônias individuais formulário. Estas colônias podem ser separados por cilindros de clonagem e células de diferentes colônias podem ser cultivadas separadamente. (A) Uma colônia representativa formada por MSCs quando plaqueadas na densidade clonal. (B) Spindle-como células derivadas de uma colônia. (C) células Rodada derivada de outra colônia.

<ol>
	<li>de Hemptinne, I., Vermeiren, C., Maloteaux, J. M., Hermans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+glial+glutamate+transporters+in+adult+mesenchymal+stem+cells.">Induction of glial glutamate transporters in adult mesenchymal stem cells.</a> J Neurochem. 91, 155-166 (2004).</li><li>Porter, R. M., Huckle, W. R., Goldstein, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+dexamethasone+withdrawal+on+osteoblastic+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells.">Effect of dexamethasone withdrawal on osteoblastic differentiation of bone marrow stromal cells.</a> J Cell Biochem. 90, 13-22 (2003).</li><li>Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+mesenchymal+stem+cells:+their+phenotype,+differentiation+capacity,+immunological+features,+and+potential+for+homing.">Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25, 2739-2749 (2007).</li><li>Abdallah, B. M., Kassem, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cells:+from+basic+biology+to+clinical+applications.">Human mesenchymal stem cells: from basic biology to clinical applications.</a> Gene Ther. 15, 109-116 (2008).</li><li>Erica, L., Herzog, L. C., Diane, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Krause+Plasticity+of+marrow-derived+stem+cells.">Krause Plasticity of marrow-derived stem cells.</a> Blood. 102, 3483-3493 (2003).</li><li>Colter, D. C., Sekiya, I., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+subpopulation+of+rapidly+self-renewing+and+multipotential+adult+stem+cells+in+colonies+of+human+marrow+stromal+cells.">Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 7841-7845 (2001).</li></ol>

Este protocolo descreve como isolar e enriquecer MSCs. Um método para separar as células-colônia única derivada é também incorporada. Há várias etapas que são importantes para uma separação de enriquecimento, isolamento e colônia de sucesso. Ao fazer o isolamento de células de rato, recomenda-se filtro através de um filtro de célula ou uma malha de nylon estéril de tamanho similar para se livrar dos coágulos de sangue e restos de ossos. Após o plaqueamento das células durante a noite, muitas células ...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1X D-PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14040-133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11885-084</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell strainer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>352350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>26140-079</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pen-Strep</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25200-056</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Imagnet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>552311</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin mouse IgG2a</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>555572</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin mouse IgG1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>555747</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin anti-rat CD54</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cedarlane Labs</td>
<td>CL054B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin anti-rat CD90</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cedarlane Labs</td>
<td>CL005B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin anti-rat CD45</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cedarlane Labs</td>
<td>CL001B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Imag buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>552362</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Round-bottom tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>352063</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin particles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>557812</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SA-PE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&amp;D systems</td>
<td>F0040</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cloning cylinder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C2059</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and enrichment of rat mesenchymal stem cells (mscs) and separation of single-colony derived mscs

MSCs são uma população de células-tronco adultas, que é uma fonte promissora para aplicações terapêuticas. Estas células podem ser isoladas a partir da medula óssea e podem ser facilmente separadas as células-tronco hematopoéticas (HSCs), devido à sua adesão plástico. Este protocolo descreve como isolar as CTMs do fémur ea tíbia de ratos. As células foram isoladas enriquecido contra dois marcadores de superfície CD54 e CD90 MSCs por separação de células magnéticas. Expressão de marcadores de superfície CD54 e CD90 foram então confirmadas por análise de citometria de fluxo. HSC marcador CD45 também foi incluído para verificar se as CTMs foram classificadas esgotado de HSCs. MSCs são naturalmente bastante heterogênea. Existem subpopulações de células que têm formas diferentes de proliferação, diferenciação e habilidades. Estas subpopulações todos expressam os marcadores conhecidos MSCs e nenhum marcador único ainda não foi identificado para o sub-populações diferentes. Portanto, uma abordagem alternativa para separar as diferentes subpopulações está usando cilindros de clonagem para separar as colônias de células derivadas única. As células derivadas de colônias de um único podem ser cultivadas e avaliados separadamente.

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Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells MSCs and Separation of Single-colony Derived MSCs

Rat CTMs foram isoladas do fémur ea tíbia e então enriquecida por separação de células magnéticas. Células classificadas foram confirmados para a expressão de marcadores de superfície por citometria de fluxo. Estas células também foram cultivadas na densidade clonal para formar colônias individuais e, em seguida essas colônias foram separados por cilindros de clonagem.

Isolamento e Enriquecimento de células-tronco mesenquimais Rat (MSC) e Separação de-colônia Único Derivado MSCs

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and ...

isolation-enrichment-rat-mesenchymal-stem-cells-mscs-separation

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells (MSCs) and Separation of Single-colony Derived MSCs

28.3K visualizações.  City of Hope Cancer Center. Rat CTMs foram isoladas do fémur ea tíbia e então enriquecida por separação de células magnéticas. Células classificadas foram confirmados para a expressão de marcadores de superfície por citometria de fluxo. Estas células também foram cultivadas na densidade clonal para formar colônias individuais e, em seguida essas colônias foram separados por cilindros de clonagem.

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Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Isolamento e Transplante de Células-Tronco Hematopoéticas (HSCs)

Biologia

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal stem cells, MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs). Both cell types are key players in maintaining the integrity of tissue and are probably also involved in regenerative processes and tumor formation.
To study their biology and function in a comparative manner it is important to have both cells types available from the same donor. It may also be beneficial for regenerative purposes to derive MSCs and ECFCs from the same tissue.
Because cellular therapeutics should eventually find their way from bench to bedside we established a new method to isolate and further expand progenitor cells without the use of animal protein. Pooled human platelet lysate (pHPL) replaced fetal bovine serum in all steps of our protocol to completely avoid contact of the cells to xenogeneic proteins.
This video demonstrates a methodology for the isolation and expansion of progenitor cells from one umbilical cord.
All materials and procedures will be described.

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

This protocol describes the isolation and subsequent expansion of mesenchymal stromal cells and endothelial colony forming cells without the use of animal serum to generate autologous pairs for experimental transplantation purposes.

Isolamento e animais de Expansão de soro livre de cordão umbilical humano Derivado células mesenquimais estromais (MSCs) e endoteliais Células Progenitoras Colony Forming (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor formation. Taken together these studies suggest that resident lung MSC play a role during pulmonary tissue homeostasis, injury and repair during diseases such as pulmonary fibrosis (PF) and arterial hypertension (PAH). Here we describe a technology to define a population of resident lung MSC. The definition of this population in vivo pulmonary tissue using a define set of markers facilitates the repeated isolation of a well-characterized stem cell population by flow cytometry and the study of a specific cell type and function.

Isolation &amp; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

In this article we demonstrate the isolation of murine resident lung mesenchymal stem cells (lung MSC), their expansion, characterization and analysis of immunomodulatory properties.

Isolamento &amp; Caracterização da Hoechst Baixa CD45 Negativo Mouse Células-Tronco Mesenquimais de pulmão

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Indução e Análise de epitelial para mesenquimal Transição

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

In 2001, researchers at the University of California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult stem cells from liposuctioned adipose tissue that they initially termed Processed Lipoaspirate Cells or PLA cells. Since then, these stem cells have been renamed as Adipose-derived Stem Cells or ASCs and have gone on to become one of the most popular adult stem cells populations in the fields of stem cell research and regenerative medicine. Thousands of articles now describe the use of ASCs in a variety of regenerative animal models, including bone regeneration, peripheral nerve repair and cardiovascular engineering. Recent articles have begun to describe the myriad of uses for ASCs in the clinic. The protocol shown in this article outlines the basic procedure for manually and enzymatically isolating ASCs from large amounts of lipoaspirates obtained from cosmetic procedures. This protocol can easily be scaled up or down to accommodate the volume of lipoaspirate and can be adapted to isolate ASCs from fat tissue obtained through abdominoplasties and other similar procedures.

In 2001, researchers at UCLA described the isolation of a population of adult stem cells, termed Adipose-derived Stem Cells or ASCs, from adipose tissue. This article outlines the isolation of ASCs from lipoaspirates using a manual, enzymatic digestion protocol using collagenase.

Isolamento manual de células-tronco adiposo-derivadas de Lipoaspirates Humanos

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolamento e Cultura da Dental epiteliais células-tronco do Adulto Rato Incisivo

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides the use of bone marrow and umbilical cord MSCs for exogenous cell therapy, there is also increasing interest in the repair and regenerative potential of resident tissue MSCs. Moreover, they likely have a role in normal organ development, and have been attributed roles in disease, particularly those with a fibrotic nature. The main hurdle for the study of these resident tissue MSCs is the lack of a clear marker for the isolation and identification of these cells. The isolation technique described here applies multiple characteristics of lung resident MSCs (L-MSCs). Upon sacrifice of the rats, lungs are removed and rinsed multiple times to remove blood. Following mechanical dissociation by scalpel, the lungs are digested for 2-3 hr using a mix of collagenase type I, neutral protease and DNase type I. The obtained single cell suspension is subsequently washed and layered over density gradient medium (density 1.073 g/ml). After centrifugation, cells from the interphase are washed and plated in culture-treated flasks. Cells are cultured for 4-7 days in physiological 5% O2, 5% CO2 conditions. To deplete fibroblasts (CD146-) and to ensure a population of only L-MSCs (CD146+), positive selection for CD146+ cells is performed through magnetic bead selection. In summary, this procedure reliably produces a population of primary L-MSCs for further in vitro study and manipulation. Because of the nature of the protocol, it can easily be translated to other experimental animal models.

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

This protocol describes an isolation technique for obtaining primary lung resident mesenchymal stromal cells from rats, through the use of enzymatic digestion, density gradient separation, plastic adherence and CD146+ magnetic bead selection.

Isolamento de CD146<sup&gt; +</sup&gt; Células Residente Lung estromais mesenquimais de rato Pulmões

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) provide a consistent ex vivo cellular system that are functionally like that of in vivo adipocytes. Use of ADSCs in biomedical research allows for cellular investigation of adipose tissue metabolic regulation and function. ADSC differentiation is necessary for adequate adipocyte expansion, and suboptimal differentiation is a major mechanism of adipose dysfunction. Understanding changes in ADSC differentiation is crucial to understanding the development of metabolic dysfunction and disease. The protocols described in this manuscript, when followed, will yield mature adipocytes that can be used for several in vitro functional tests to assess ADSC metabolic function, including but not limited to assays measuring glucose uptake, lipolysis, lipogenesis, and secretion. Rhesus macaques (Macaca mulatta) are physiologically, anatomically, and evolutionarily similar to humans and as such, their tissues and cells have been used extensively in biomedical research and for development of treatments. Here, we describe ADSC isolation using fresh subcutaneous and omental adipose tissue obtained from 4&#8211;9-year old rhesus macaques. Adipose tissue samples are enzymatically digested in collagenase followed by filtration and centrifugation to isolate ADSCs from the stromal vascular fraction. Isolated ADSCs are proliferated in stromal media followed by approximately 14&#8211;21 days of differentiation using a cocktail of 0.5 &#956;g/mL dexamethasone, 0.5 mM isobutyl methylxanthine, and 50 &#956;M indomethacin in stromal media. Mature adipocytes are observed at approximately 14 days of differentiation. In this manuscript, we describe protocols for ADSC isolation, proliferation, and differentiation in vitro. Although, we have focused on ADSCs from rhesus macaque adipose tissue, these protocols can be utilized for adipose tissue obtained from other animals with minimal adjustments.

In this article, we describe isolation of rhesus macaque derived adipose-derived stem cells (ADSCs) using an enzymatic tissue digestion protocol. Next, we describe ADSC proliferation which includes cell detachment, counting and plating. Lastly, ADSC differentiation is described using specific adipogenic inducing agents. Additionally, we describe staining techniques to confirm differentiation.

Isolamento, Proliferação e Diferenciação de Células-Tronco Derivadas de Adiposos de Macacos Rhesus

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological regulators of organismal homeostasis and important indicators of pathologies; in the meantime, their immense potential to establish accessible and controllable disease therapeutics is emerging. Mesenchymal stem cells (MSCs) can release large amounts of EVs in culture, which have shown promise to jumpstart effective tissue regeneration and facilitate extensive therapeutic applications with good scalability and reproducibility. There is a growing demand for simple and effective protocols for collecting and applying MSC-EVs. Here, a detailed protocol is provided based on differential centrifugation to isolate and characterize representative EVs from cultured human MSCs, exosomes, and microvesicles for further applications. The adaptability of this method is shown for a series of downstream approaches, such as labeling, local transplantation, and systemic injection. The implementation of this procedure will address the need for simple and reliable MSC-EVs collection and application in translational research.

The present protocol describes the differential centrifugation for isolating and characterizing representative EVs (exosomes and microvesicles) from cultured human MSCs. Further applications of these EVs are also explained in this article.

Isolamento, Caracterização e Aplicação Terapêutica de Vesículas Extracelulares a partir de Células-Tronco Mesenquimais Humanas Cultivadas

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

Isolamento e caracterização de células-tronco derivadas do tecido adiposo

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in addition to their great capacity for self-renewal, migration, and proliferation. Adipose tissue is one of the least invasive and most accessible sources of mesenchymal cells. It has also been reported to have higher yields compared to other sources, as well as superior immunomodulatory properties. Recently, different procedures for obtaining adult mesenchymal cells from different tissue sources and animal species have been published. After evaluating the criteria of some authors, we standardized a methodology that is applicable to different purposes and easily reproducible. A pool of stromal vascular fraction (SVF) from perirenal and epididymal adipose tissue allowed us to develop primary cultures with optimal morphology and functionality. The cells were observed adhered to the plastic surface for 24 h, and exhibited a fibroblast-like morphology, with prolongations and a tendency to form colonies. Flow cytometry (FC) and immunofluorescence (IF) techniques were used to assess the expression of the membrane markers CD105, CD9, CD63, CD31, and CD34. The ability of adipose-derived stem cells (ASCs) to differentiate into the adipogenic lineage was also assessed using a cocktail of factors (4 &#181;M insulin, 0.5 mM 3-methyl-iso-butyl-xanthine, and 1 &#181;M dexamethasone). After 48 h, a gradual loss of fibroblastoid morphology was observed, and at 12 days, the presence of lipid droplets positive to oil red staining was confirmed. In summary, a procedure is proposed to obtain optimal and functional ASC cultures for application in regenerative medicine.

Autor em destaque: Isolamento e identificação de células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo de ratos Sprague Dawley  

This protocol describes a methodology for isolating and identifying adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (MSCs) from Sprague Dawley rats.

Isolamento e Identificação de Células-Tronco Mesenquimais Derivadas do Tecido Adiposo de Ratos Sprague Dawley

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...