Reconhecemos a ajuda fornecida por Lourdes Delta Arrueta Antequera (Departamento de Entomologia, Ohio State University / OARDC, Wooster, OH) na instalação dos experimentos. Agradecemos ao Dr. Therese Polónia (USDA, Serviços Florestais, NRS) para enviar amostras EAB larval. Ajuda fornecida pelo Dr. Luis Um Canas e Nuris M Acosta com a configuração do microscópio é apreciado. O financiamento para este projeto foi fornecido pelo Estado e Federal fundos apropriados para o Ohio Agricultural Research e Development Center, The Ohio State University.

O protocolo completo, com diferentes passos é descrito no fluxograma na Figura 1. Medidas individuais que constituem a dissecação, extração de RNA, a síntese de cDNA e Strand Primeiro qRT-PCR são detalhados abaixo. I. Dissecção larval <ol><li> Antes do início deste procedimento, coloque broca cinzas Emerald, ou EAB, larvas com papel de filtro úmido, até dissecções são executadas. Mantenha recém-fosfato preparado 1X solução salina, ou PBS, em gelo para manter o frio em todo o buffer de dissecção. </li><li> Para começar, corrigir as larvas EAB na placa de dissecção com pinos de dissecção fina. Em seguida, adicione o frio 1X PBS para a placa de dissecação. </li><li> Primeiro, decapitar larvas com um belo par de tesouras de dissecação. Posteriormente, remover o último segmento abdominal das larvas. </li><li> Usando um par de fórceps relojoeiro, levante a cutícula da carcaça larval. Então, faça uma incisão ao longo do comprimento da carcaça usando um par de tesouras. Tome cuidado para não romper o intestino como a incisão é feita. </li><li> Cuidadosamente isolar o tecido do intestino médio de outros tecidos, como corpos de gordura e tecido conjuntivo. Depois, lave o tecido em tampão PBS 1X fresco para garantir que não há contaminação do fatbody. Transferir o intestino isolado para 500 mL de pré-refrigerados reagente Trizol em um tubo eppendorf 1,5 mL. </li><li> Em seguida, isolar o tecido de gordura corporal usando uma pinça e transferi-lo para um tubo eppendorf 1,5 mL contendo 500 mL de reagente Trizol refrigerados. </li><li> Finalmente, isolar o tecido cutícula da carcaça larval por demolição de desconto em qualquer tecido conjuntivo aderente, tomando cuidado para não prejudicar a integridade do tecido. Lave o tecido cutícula isolados em fresco tampão PBS e transferir para um tubo eppendorf 1,5 mL com 500 mL de reagente Trizol refrigerados. </li><li> O tecido adiposo isolado cutícula corpo, e intestino podem ser armazenadas a -80 ° C até a extração de RNA. </li><li> Em preparação para a extração de RNA, uma espécie EAB das amostras de acordo com os vários estágios de desenvolvimento. Estas etapas incluem 1, 2, 3, e 4 º ínstares prepupas e adultos. </li></ol> II. Extração de RNA (Como protocolo do fabricante por s para o uso de reagente Trizol) Homogeneização <ol><li> Para começar a extração de RNA, primeiro use pilões de plástico para homogeneizar os tecidos do Trizol contendo tubos de 1,5 mL eppendorf. Após homogeneização, atingindo um volume total de cada mL de amostra para 1 com o reagente Trizol. </li><li> Para as fases de desenvolvimento, homogeneizar animal inteiro em nitrogênio líquido com um almofariz e um pilão. Em seguida, adicione uma alíquota do homogenato (50 mg) a 1 mL de Trizol. </li></ol> Separação de fases: <ol start="3"><li> Incubar os tubos de amostra com 1 mL Trizol por 15 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Após a incubação, adicionar 200μL de clorofórmio para cada tubo. Imediatamente após a adição de clorofórmio, agitar os tubos vigorosamente por cerca de 15 segundos. Então, incubar os tubos em temperatura ambiente por mais 2-3 minutos. </li><li> Em seguida, centrifugue as amostras a 12.000 Xg por 15 minutos a 2 ° C. Após a centrifugação, o RNA será na fase aquosa. O volume da fase aquosa deve ser de 600 mL, ou 60% do volume total de Trizol. </li></ol> RNA precipitação <ol start="6"><li> Remova cuidadosamente apenas a fase aquosa. Presença de substâncias abaixo da fase aquosa vai causar contaminação do RNA extraído. Em seguida, transferir a fase aquosa para um 1,5 mL devidamente rotulados tubo eppendorf. </li><li> Para precipitar o RNA a partir da fase aquosa, misturar 0,5 mL de álcool isopropílico para cada tubo. Incubar as amostras à temperatura ambiente por 10 minutos. Após a incubação, os tubos de centrífuga a 12.000 Xg por 10 minutos a 2 ° C. </li></ol> RNA Wash <ol start="8"><li> Após a centrifugação, desprezar o sobrenadante dos tubos. RNA está presente no gel-like pellet formado no fundo do tubo. Lave o pellet com etanol 75%, somando pelo menos 1 mL de etanol 75% por 1 mL de Trizol. Misturar em vortex. Então, os tubos de centrífuga em 7500Xg por 5 minutos a 2 ° C. </li></ol> RNA eluição <ol start="9"><li> Desprezar o sobrenadante dos tubos. Centrifugue os tubos novamente na centrífuga pequena mesa por 1 minuto. Remova qualquer excesso de sobrenadante do tubo por pipetagem cuidadosa. Deixar o tubo aberto e deixar o ar seco pellet por 5-10 minutos. Tenha cuidado para não secar o pellet sobre como isso irá diminuir significativamente a sua solubilidade. </li><li> Após secagem ao ar, ressuspender o sedimento em <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/Diethylpyrocarbonate">diethylpyrocarbonate</a> , ou DEPC, água tratada. A quantidade de água utilizada para ressuspender o sedimento vai depender do tamanho do pellet. Use 50 mL de água tratada DEPC para um smtodos mL pellet ou 100 para um pellet grande. Deixe o pellet dissolver completamente na água tratada DEPC movendo a ponta da pipeta cima e para baixo várias vezes. </li><li> Uma vez que o pellet foi dissolvido, colocar a amostra a 55 ° C por 10 minutos. </li><li> Então, medir a concentração de cada amostra de RNA usando um espectrofotômetro Nanodrop (2 mL da amostra de RNA). </li><li> Armazenar as amostras de RNA a -80 ° C até à sua utilização. </li></ol> III. Strand-primeira síntese de cDNA (Como protocolo do fabricante por s usando kit Síntese SuperScript primeira vertente pela Invitrogen). <ol><li> Para cada amostra de RNA adicione o seguinte em um tubo de PCR: <table border="0"><tbody><tr><td> RNA </td><td> mL x </td></tr><tr><td> 10mM dNTP mix M </td><td> 1μl </td></tr><tr><td> Oligo (dt) (0,5 mg / mL) </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> DEPC água tratada </td><td> (8-x) mL </td></tr><tr><td> Volume Total: </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Nota: x é o volume de RNA usada para a síntese de cDNA. Dependendo da concentração do RNA, 2-3 mg de RNA serão utilizados para cada reação e do volume total de cada reação deve ser 10 ml. </td></tr></tbody></table></li><li> Coloque a mistura de reacção acima em um termociclador a 65 ° C por 4 minutos. </li><li> Remover os tubos do theromocyler e colocá-los no gelo imediatamente para pelo menos 2 minutos. </li><li> Prepare a primeira vertente master mix, adicionando o seguinte: <table border="0"><tbody><tr><td> Tampão RT 10X </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> 25mM MgCl 2 </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> 0,1 M DTT </td><td> 2 l </td></tr><tr><td> RNase fora </td><td> 1 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Adicionar 9 mL de master mix a cada tubo contendo a amostra de RNA, misturar por pipetagem e centrifugar brevemente a mistura. </li><li> Coloque os tubos de volta no termociclador e incubar por 2 minutos a 42 ° C. </li><li> Pause o termociclador e adicionar 1 ml de Sobrescrito II enzima transcriptase reversa (Invitrogen) para cada tubo. Esta etapa deve ser feito rapidamente. </li><li> Incubar as amostras a 42 ° C por 1,5 horas. </li><li> Finalizar a reação a 70 ° C por 15 minutos. </li><li> Remover os tubos do termociclador e colocá-los no gelo. </li><li> Adicionar 1 ml de RNase H a cada tubo e colocá-los de volta no termociclador a 37 ° C por 20 minutos. </li><li> Depois de tirar as amostras fora do termociclador, adicionar 20 mL de água livre de nuclease em cada tubo. O volume de cada amostra é dobrado nesta fase. </li><li> Verificar a concentração de cada amostra usando 2 mL da amostra. Tome alíquota de cada amostra, para fazer a concentração de 20ng/μl para uso em qRT-PCR. A quantidade de água para compensar as amostras a uma concentração de 20ng/μl dependerá da concentração inicial do cDNA sintetizado. </li></ol> IV. qRT-PCR: Design de primer e Determinação do gene referência <ol><li> Primers de design com uma temperatura de fusão (Tm) de 60 ° C e um tamanho de produto de ~ 100bp. </li><li> AP-PERI1 é usado como o gene de interesse para esta experiência. Um gene de referência ou de controle interno é necessária para posterior análise e normalização dos dados. Proteína ribossomal (AP-RP1) é usado como gene de referência para este experimento. </li><li> Prepare 5um stocks de trabalho dos primers que serão utilizados, incluindo o seu gene de referência. </li></ol> Elaboração de normas <ol start="4"><li> Para calcular a eficiência dos primers sendo usado normas devem ser feitas. </li><li> Faça uma mistura do cDNA a partir de diferentes amostras que serão testadas. </li><li> 5X fazer diluições seriadas para cada ponto desejado no gráfico. Quatro diluições devem ser o suficiente, mas cinco são altamente recomendados. </li><li> O volume vai variar dependendo de quantos pontos e quantos técnicos replica estão sendo usados. Não deve ser suficiente para fazer um padrão para cada gene a ser testado, incluindo o gene de referência. </li></ol> Template placa <ol start="8"><li> Criar um modelo indicando o nome da amostra para cada poço da placa de qRT-PCR. Lembre-se de incluir padrões para cada gene e pelo menos dois técnicos repetições por amostra. </li></ol> Configurar os parâmetros de ciclismo <ol start="9"><li> Ligue a máquina de qRT-PCR e entrar os parâmetros de bicicleta. Os parâmetros de ciclismo para este experimento é a seguinte: Passo 1: <ul><li> Um ciclo: 95 min 3 ° C </li></ul> Passo 2: <ul><li> 40 ciclos: 95 ° C 15 segundos seguido de 60 ° C 30 segundos (Opcional: para determinar a curva de fusão incluir as seguintes etapas) </li></ul&gt; Passo 3: <ul><li> Um ciclo: 95 ° C 1 min </li></ul> Passo 4: <ul><li> 1cycle: 55 ° C 1 min </li></ul> Passo 5: <ul><li> 81 ciclos: 55 ° C 30 segundos </li></ul></li></ol> Placa configurada para CFX96 (BioRad) máquina <ol start="11"><li> Prepare a mistura de mestre para cada gene (incluindo o gene de referência) em tubo separado. Para cada bem, a mistura principal consiste em <table border="0"><tbody><tr><td> Água livre de nuclease </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> 2.5 X SYBR green </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> Primer para a frente </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Reverse Primer </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Volume total </td><td> 8 mL </td></tr></tbody></table></li><li> Durante a preparação do master mix incluem 02/01 reações extra para contabilizar erros de pipetagem. </li><li> De acordo com o modelo previamente elaborado, adicione 2 mL (20 ng / mL) de cDNA para cada poço. Então, adicionar 8 mL da mistura principal a cada poço, resultando em um volume total de 10 mL por reação. </li><li> Pipeta cima e para baixo (2-3X) para garantir que a amostra é bem misturado. Verifique se o líquido não permanece na ponta. Para evitar a contaminação cruzada, use uma nova ponta para cada amostra. </li><li> Uma vez que toda a placa está configurada, cobrir a placa com fita óptica. Evite tocar a fita como a presença de gordura pode afetar a leitura. Em seguida, centrifugar a placa a 500 rpm por 1 minuto para assegurar que todos os produtos nos poços estão na parte inferior da placa. </li><li> Após centrifugação, verifique se não há gelo ou água no fundo do prato. Finalmente, colocar a placa na máquina qRT-PCR e PCR executar o programa. </li></ol> V. Representação diagramática do Experimento <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Fluxograma representando a ordem seqüencial de etapas para o estudo da expressão gênica. <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: A) larval dissecção EAB mostrando intestino médio no meio. B) do intestino médio de larvas isoladas EAB <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3: A) A média de valores de expressão relativa (REVs) para um gene peritrophin (AP-PERI1) em diferentes tecidos, incluindo cutícula larval (Cu), intestino (MG) ​​e órgãos de gordura (FB). Uma proteína específica EAB ribossomal (doravante, AP-RP1) foi utilizado como controle interno para normalizar os dados obtidos para o gene de interesse, AP-PERI1. B) Variação relativa dobra de AP-PERI1 em tecidos larval. O tecido cutícula mostrou o menor expressão e, portanto, foi tomado como o calibrador (1X) amostra (Pfaffl, 2001). <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4: A) A média de valores de expressão relativa (REVs) para um gene peritrophin (AP-PERI1) em diferentes estágios de desenvolvimento da EAB incluindo estágios larvais (1, 2, 3 e 4), pré-pupa (PP) e adultos (A). Uma proteína específica EAB ribossomal (AP-RP1) foi utilizado como controle interno para normalizar os dados obtidos para o gene de interesse, AP-PERI1. B) Variação relativa dobra de AP-PERI1 em vários estágios de desenvolvimento. A amostra PP mostrou o menor nível de níveis de mRNA e, portanto, foi tomado como o calibrador (1X amostra). VI. Conclusão Quantitativas PCR em tempo real (qRT-PCR) é uma ferramenta eficaz para diagnosticar os níveis de mRNA nos tecidos do inseto e estágios diferentes de desenvolvimento. Além disso, qRT-PCR tem sido principalmente a ferramenta chave para validar os dados gerados a partir de alto rendimento análises de expressão gênica, tais como microarrays ea nova geração de RNA-Seq.

<ol>
	<li>Lehane, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peritrophic+matrix+structure+and+function.">Peritrophic matrix structure and function.</a> Annu Rev Entomol. 42, 525-550 (1997).</li><li>Mittapalli, O., Sardesai, N., Shukle, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cDNA+cloning+and+transcriptional+expression+of+a+peritrophin-like+gene+in+the+Hessian+fly,+Mayetiola+destructor+[Say].">cDNA cloning and transcriptional expression of a peritrophin-like gene in the Hessian fly, Mayetiola destructor [Say].</a> Arc of Insect Bio. 64, 19-29 (2007).</li><li>Pauchet, Y., Wilkinson, P., van Munster, M., Augustin, S., Pauron, D., ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+of+the+midgut+transcriptome+of+the+poplar+leaf+beetle+Chrysomela+tremulae+reveals+new+gene+families+in+Coleoptera.+Ins+Bio+and+Mol.">Pyrosequencing of the midgut transcriptome of the poplar leaf beetle Chrysomela tremulae reveals new gene families in Coleoptera. Ins Bio and Mol.</a> 39, 403-413 (2009).</li><li>Pfaffl, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR.">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2002-2007 (2001).</li><li>Tellam, R. L., Lehane, M. J., Billingsley, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of the Insect Midgut. , 86-114 (1996).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Os ciclos de limiar (Ct) valor é obtido para cada amostra na placa de qRT-PCR. Para fazer a curva padrão, o valor de Ct obtidos para cada diluição foi em função do log da sua concentração. Os valores de Ct para as amostras experimentais foram então desenhados para esta curva padrão de diluição em série. Quantidades alvo foram calculados a partir de distintas curvas padrão gerada para cada tecido ou seja, experiência e expressão de desenvolvimento. Os valores de expressão relativa (REVs) foram, então, d...

analysis of gene expression in emerald ash borer (agrilus planipennis) using quantitative real time-pcr

Emerald broca de cinzas (EAB,<em&gt; Agrilus planipennis</em&gt;) É uma praga exótica invasora, que já matou milhões de árvores de cinzas (<em&gt; Fraxinus</em&gt; Spp) na América do Norte.<strong&gt;</strong&gt; EAB continua a se espalhar rapidamente e ataques de cinzas árvores de diferentes idades, a partir de mudas de árvores maduras. No entanto, até à data pouco ou nenhum conhecimento molecular existe para EAB. Estamos interessados ​​em decifrar os processos moleculares baseados fisiológicas ao nível do tecido que EAB ajuda na colonização bem sucedida de freixos. Neste relatório, nós mostramos o uso eficaz dos quantitativos PCR em tempo real (qRT-PCR) para verificar os níveis de mRNA em diferentes tecidos larval (incluindo intestino, gordura corpos e cutícula) e diferentes estágios de desenvolvimento (incluindo 1<sup&gt; St</sup&gt; -, 2<sup&gt; Nd</sup&gt; -, 3<sup&gt; Rd</sup&gt; -, 4<sup&gt; Th</sup&gt;-Prepupas estádios e adultos) da EAB. Como exemplo, um gene peritrophin (doravante,<em&gt; AP-PERI1</em&gt;) É exemplificado como o gene de interesse e uma proteína ribossomal (<em&gt; AP-RP1</em&gt;) Como o controle interno. Peritrophins são componentes importantes da membrana peritrófica / matriz (PM), que é o revestimento do intestino do inseto. A PM tem diversas funções, incluindo a digestão e proteção mecânica ao epitélio do intestino médio.

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Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitativas PCR em tempo real (qRT-PCR) é uma ferramenta eficaz para diagnosticar os níveis de mRNA nos tecidos do inseto e estágios diferentes de desenvolvimento. Neste relatório, nós mostramos o uso de qRT-PCR para verificar os níveis de mRNA em diferentes tecidos e estágios de desenvolvimento larval das espécies de insetos invasivos, esmeralda broca cinzas.

Análise de Expressão Gênica em Emerald Borer Ash ( Agrilus planipennis) Usando Quantitativa em Tempo Real-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

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Biology

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

10.6K visualizações.  The Ohio State University. Quantitativas PCR em tempo real (qRT-PCR) é uma ferramenta eficaz para diagnosticar os níveis de mRNA nos tecidos do inseto e estágios diferentes de desenvolvimento. Neste relatório, nós mostramos o uso de qRT-PCR para verificar os níveis de mRNA em diferentes tecidos e estágios de desenvolvimento larval das espécies de insetos invasivos, esmeralda broca cinzas.

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Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Análise de Expressão Gênica Utilizando bacteriana Microarrays

Biologia

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Análise da expressão global de Gene usando uma plataforma Microarray Zebrafish Oligonucleotide

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Usando o Sistema de Eletroporação Gene Pulser MXcell para transfectar pilhas com Alta Eficiência

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Quantitativas Real-Time PCR usando o Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Usando um contador de células automatizadas para simplificar Estudos da Expressão Gênica: Knockdown siRNA de Expressão IL-4 Gene Dependente em células NAMALWA

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Perfil dos pré-micro RNAs e microRNAs usando Quantitative PCR em tempo real (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Determinar perfis de expressão genética em C. elegans Usando Microarray e PCR em tempo real

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análise da Global RNA Síntese no nível da célula única seguinte hipóxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...