Esta pesquisa foi financiada pelos Projetos da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32172476, 32102275), pelo Programa de Inovação em Ciência e Tecnologia Agrícola (CAAS-ZDRW202203, CAAS-ZDRW202108) e pelos Fundos Centrais Orientando o Desenvolvimento Científico e Tecnológico Local (XZ202301YD0042C).

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, instrumentos, software e reagentes usados neste protocolo.
1. Coleta e manutenção da cultura de insetos
<ol><li>Aderir um grupo de ~5.000 ovos de Corcyra cephalonica (Stainton) em um cartão de 9 cm por 16 cm usando uma solução 1:5 (v/v) de goma arábica em pó e água25,26. NOTA: Evite anexar muitos ovos de anfitrião ao cartão, pois a superlotação torna impraticável para procedimentos subsequentes de transferência e dissecação.</li>
	<li>Para evitar a eclosão dos ovos do hospedeiro, sujeitar os cartões de ovos do hospedeiro a 30 min de irradiação ultravioleta (UV) (Figura 1-i). Em seguida, corte o papel com ovos inativados em cartões de ovos medindo 1 cm de espessura e 8 cm de diâmetro, cada um contendo aproximadamente 300-500 ovos (Figura 1-ii)25,26,27.</li>
	<li>Introduzir uma coorte de 80-120 vespas T. denrolimi em um tubo de vidro medindo 2 cm de diâmetro e 8 cm de comprimento. Sele o tubo com algodão. NOTA: Manter as vespas a uma temperatura de 25 ± 1 °C, com um ciclo claro/escuro de 16 h de luz e 8 h de escuridão e manter uma umidade relativa de aproximadamente 75%.</li>
	<li>Apresentar um cartão de ovo hospedeiro às vespas para parasitização (Figura 1-ii). Permita que as vespas depositem seus ovos nos ovos hospedeiros por 6 h, após o que imediatamente remover as vespas. NOTA: Evitar prolongar excessivamente o período de parasitização, pois isso pode levar à superlotação da prole de T. denrolimi dentro de um ovo hospedeiro, resultando em aumento da mortalidade da vespa da prole28,29.</li>
</ol>2. Síntese de dsRNA
<ol><li>Projetar conjuntos de primers contendo um promotor T7 para a síntese de RNA de fita dupla (dsRNA). Escolha um segmento de 300-400 pb do gene alvo (Ferhch) para a síntese de dsRNA.</li>
	<li>Adquirir conjuntos de primers sintetizados comercialmente para a produção de dsRNA para o gene alvo e dsGFP para uso como controle negativo.</li>
	<li>Extrair o conteúdo de RNA de 100 vespas T. denrolimi usando o kit referenciado seguindo o protocolo do fabricante9. Verificar a qualidade do conteúdo de RNA; prossiga se o valor de OD260/OD280 variar de 1,8 a 2,09.</li>
	<li>Purificar o conteúdo de RNA com 2 μL de tampão 5x (1 U/50 μL), 1 μL de DNAse (1 U/50 μL) e 6,5 μL de RNA (~100 ng/μL), 0,5 μL de H2O a 42 °C por 2 min.</li>
	<li>Realizar reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR) para gerar um molde de cDNA com 10 μL de RNA purificado (~100 ng/μL), 4 μL de tampão 5x (1 U/50 μL), 1 μL de Enzyme Mix I (1 U/50 μL) e 4 μL de H2O. Realize RT-PCR usando as seguintes configurações: 37 °C durante 15 min, 85 °C por 5 s. Conservar o produto de cDNA a -4 °C até à utilização.</li>
	<li>Realizar reação em cadeia da polimerase (PCR) para amplificar as sequências de dsRNA de acordo com a mistura mestre referenciada (10 μL de Taq II [1 U/50 μL], 0,8 μL de primer forward [0,4 μM], 0,8 μL de primer reverso [0,4 μM], 0,8 μL de molde de DNA [40 ng/μL] e 7,6 μL de H2O). Realizar PCR usando as seguintes configurações: 94 °C por 2 min; 35 ciclos com 94 °C por 30 s, 60 °C por 30 s, 72 °C por 30; 72 °C por 2 min.</li>
	<li>Avaliar a qualidade dos produtos de PCR por eletroforese em gel de agarose a 2,0% 5,9 e confirmar a sequência alvo através do sequenciamento de Sanger.</li>
	<li>Purificar o produto da PCR utilizando o Kit de Extração em Gel conforme orientação do fabricante 9,23.</li>
	<li>Utilizar um sistema RNAi para sintetizar dsRNA para o gene alvo com 10 μL de tampão 2x (0,02 U/μL), 8 μL de molde de DNA (75 ng/μL) e 2 μL de mistura enzimática (1 U/50 μL) com as seguintes configurações: 37 °C por 30 min, 70 °C por 10 min e 25 °C por 20 min. Eluir o dsRNA sintetizado com 30 μL de Água Livre de Nuclease.</li>
	<li>Avaliar a qualidade do produto de dsRNA visualizando-o em gel de agarose a 1,0% 5,9. Diluir o dsRNA para 7.000 ng/μL. Verificar a qualidade do produto dsRNA; prossiga se o valor de OD260/OD280 variar de 1,8 a 2,09. Conservar o produto dsRNA a -20 °C até à utilização.</li>
</ol>3. Transplante de pupas de T. denrolimi
<ol><li>Cultivar os ovos do hospedeiro parasitado por aproximadamente 8 dias a 25 ± 1°C, mantendo um ciclo claro/8 h escuro de 16 h e umidade relativa de ~75%. Os ovos do hospedeiro parasitado escurecerão após5 dias 30 (Figura 1-iv,v).</li>
	<li>Transfira o cartão do ovo hospedeiro para um microscópio dissecante. Empregar um par de agulhas de tungstênio (Figura 1-vi) para remover meticulosamente o córion dos ovos hospedeiros (Figura 1-vii) e recuperar a pupa de dentro (Figura 1-viii)5,17,18. NOTA: A ponta da agulha dissecante deve ser inferior a 0,05 mm.</li>
	<li>Prepare uma placa limpa para o substrato. Despejar 10-15 mL de uma solução de ágar 15 g/L, permitindo esfriar naturalmente (Figura 2-i). NOTA: Misturar a solução de ágar com 0,5 g de estreptomicina para inibir o crescimento de contaminantes in vitro.</li>
	<li>Empregar um gravador desinfetado para condicionar vários sulcos medindo 0,2-0,3 mm de profundidade e 0,4-0,8 mm de largura (Figura 2-ii).</li>
	<li>Utilizar uma pequena escova (Figura 2-iii) para transplantar uma pupa do ovo hospedeiro dissecado para um dos sulcos do substrato ágar (Figura 2-iv).</li>
	<li>Repetir os passos 3.4 e 3.5, transplantando 100-300 pupas individualmente nos sulcos, uma a uma (Figura 2-v).</li>
</ol>4. Micro-injeção de dsRNA em T. denrolimi pupa
<ol><li>Utilizar extrator com agulha de vidro para tracionar capilar de vidro (Figura 3-i,ii). Ajuste o Heat para 280, o Velocity para 170, o Delay para 250 e o Pull para 30 em um extrator de agulha (Figura 3-iii). Preparar múltiplas agulhas de vidro capilar para microinjeção (Figura 3-iv,v).</li>
	<li>Biselar a ponta da agulha de vidro com placa abrasiva (Figura 3-vi). NOTA: Certifique-se de que a ponta da agulha de injeção permanece afiada; caso contrário, pode resultar em mortalidade pupal ou impedir o fluxo de reagentes através da agulha (Figura 3-vii).</li>
	<li>Carregar aproximadamente 2 μL da solução de injeção de dsRNA com 7.000 ng/μL na agulha de injeção preparada usando uma microbomba de injeção (Figura 3-vii).</li>
	<li>Transfira o substrato de ágar contendo centenas de pupas para a plataforma de um microscópio composto (Figura 3-viii).</li>
	<li>Insira cuidadosamente a agulha de injeção no abdome de uma pupa de T. denrolimi em um ângulo de ~30° em relação ao abdome sob a lente (Figura 3-ix).</li>
	<li>Injetar gradualmente ~5 nL da solução de injeção (passo 4.3) na pupa de T. denrolimi o mais suavemente possível. NOTA: A pupa de T. denrolimi pode inchar ligeiramente à medida que a solução de dsRNA é injetada. Injetar uma quantidade excessiva de solução na pupa ou usar agulhas com aberturas excessivamente grandes pode resultar em morte prematura da pupa. Troque as agulhas quando ficarem entupidas depois de injetar várias a dezenas de pupas.</li>
	<li>Repita as etapas 4.5 e 4.6, injetando dsRNA em 600 pupas uma a uma. NOTA: Para uma análise confiável de RT-qPCR, o conteúdo de RNA deve ser isolado de pelo menos 100 pupas. Injetar pelo menos 600 pupas para três repetições no tratamento com dsRNA e três repetições no controle negativo para dsGFP 9.</li>
</ol>5. Incubação de pupas de T. denrolimi
<ol><li>Transfira o substrato contendo pupas injetadas para uma incubadora a 25 ± 1 °C com um ciclo claro/escuro de 16 h/8 h e ~75% UR.</li>
	<li>Incubar aproximadamente 700 pupas de T. denrolimi por tratamento durante 24 h ou 48 h. Extrair o conteúdo de RNA de um grupo de 100 pupas por réplica9. OBS: Retirar as pupas encolhidas (pupas mortas) das amostras; caso contrário, pode resultar em erros na detecção da expressão gênica.</li>
	<li>Incubar ~50 pupas de T. denrolimi por tratamento até que as vespas surjam (Figura 3-x). Registre a taxa de emergência e a taxa de deformidade.</li>
</ol>6. Detecção da expressão gênica direcionada
<ol><li>Projete o conjunto de primers para o gene alvo e genes de referência para RT-qPCR usando uma ferramenta de design. NOTA: Certifique-se de que as sequências dos primers RT-qPCR não se sobreponham à região alvo do dsRNA.</li>
	<li>Empregar o gene forkhead box O (FoxO) como gene de referência na análise de RT-qPCR; os primers de FoxO foram relatados anteriormente9.</li>
	<li>Obter conjuntos de primers sintetizados comercialmente. Realizar RT-qPCR com 10 μL de Taq II (1 U/50 μL), 0,8 μL de primer forward (0,4 μM), 0,8 μL de primer reverso (0,4 μM), 0,8 μL de template (10 ng/μL) e 7,6 μL de H2O. Realizar RT-qPCR usando as seguintes configurações: 95 °C por 30 s; 35 ciclos com 95 °C por 5 s, 57 °C por 30 s, 72 °C por 30; 95 °C por 10 s; 60 °C por 5 s e 95 °C por 5 s.</li>
	<li>Calcular o valor de expressão do gene alvo utilizando o método 2-ΔΔCt 9,25.</li>
	<li>Empregar o teste de Kruskal-Wallis para analisar a expressão do gene alvo sob a influência de diferentes tratamentos (dsFerhch, dsGFP, não injeção). NOTA: Evite o uso de testes paramétricos (por exemplo, teste t) para comparações post-hoc, pois a heterocedasticidade e a não normalidade dos dados podem levar a conclusões errôneas25.</li>
</ol>

Técnicas avançadas de RNAi em Trichogramma dendrolimi para análise da função gênica

<ol>
	<li>Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+control+with+Trichogramma+in+China:+History,+present+status+and+perspectives.">Biological control with Trichogramma in China: History, present status and perspectives.</a> Annu Rev Entomol. 66, 463-484 (2020).</li><li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+clutch+size+for+quality+control+of+bisexual+and+Wolbachia-infected+thelytokous+lines+of+Trichogramma+dendrolimi+Matsumura+(Hymenoptera:+Trichogrammatidae)+mass+reared+on+eggs+of+a+substitutive+host,+Antheraea+pernyi+Gu&#233;rin-M&#233;neville+(Lepidoptera:+Saturniidae).">Optimal clutch size for quality control of bisexual and Wolbachia-infected thelytokous lines of Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) mass reared on eggs of a substitutive host, Antheraea pernyi Gu&#233;rin-M&#233;neville (Lepidoptera: Saturniidae).</a> Pest Manag Sci. 76 (8), 2635-2644 (2020).</li><li>Li, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+the+biological+control+of+the+fall+armyworm+Spodoptera+frugiperda+by+egg+parasitoids.">Current status of the biological control of the fall armyworm Spodoptera frugiperda by egg parasitoids.</a> J Pest Sci. 96, 1345-1363 (2023).</li><li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+and+superparasitism+on+quality+and+characteristics+of+thelytokous+Wolbachia-infected+Trichogramma+dendrolimi+Matsumura+(Hymenoptera:+Trichogrammatidae)+during+mass+rearing.">Effects of temperature and superparasitism on quality and characteristics of thelytokous Wolbachia-infected Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) during mass rearing.</a> Sci Rep. 9 (1), 18114 (2019).</li><li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetrance+during+Wolbachia-mediated+parthenogenesis+of+Trichogramma+wasps+is+reduced+by+continuous+oviposition,+associated+with+exhaustion+of+Wolbachia+titers+in+ovary+and+offspring+eggs.">Penetrance during Wolbachia-mediated parthenogenesis of Trichogramma wasps is reduced by continuous oviposition, associated with exhaustion of Wolbachia titers in ovary and offspring eggs.</a> Pest Manag Sci. 78 (7), 3080-3089 (2022).</li><li>Huang, N. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+and+large-scale+releases+of+Trichogramma+promote+pesticide+decrease+in+maize+in+northeastern+China.">Long-term and large-scale releases of Trichogramma promote pesticide decrease in maize in northeastern China.</a> Entomol Gen. 40 (4), 331-335 (2020).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+Trichogramma+japonicum+as+a+vector+of+Beauveria+bassiana+for+parasitizing+eggs+of+rice+striped+stem+borer,+Chilo+suppressalis.">Performance of Trichogramma japonicum as a vector of Beauveria bassiana for parasitizing eggs of rice striped stem borer, Chilo suppressalis.</a> Entomol Gen. 41 (2), 147-155 (2021).</li><li>Ning, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+and+expression+pattern+of+the+sex+determination+genes+and+their+sex-specific+variants+in+the+egg+parasitoid+Trichogramma+dendrolimi+Matsumura+(Hymenoptera:+Trichogrammatidae).">The identification and expression pattern of the sex determination genes and their sex-specific variants in the egg parasitoid Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae).</a> Front Physiol. 14, 1243753 (2023).</li><li>Huo, L. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+and+evaluation+of+RT-qPCR+reference+genes+for+expression+analysis+in+the+tiny+egg+parasitoid+wasp,+Trichogramma+dendrolimi+Matsumura+(Hymenoptera:+Trichogrammatidae).">Selection and evaluation of RT-qPCR reference genes for expression analysis in the tiny egg parasitoid wasp, Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae).</a> J Asia Pac Entomol. 25 (2), 101883 (2022).</li><li>Leung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+biological+control:+the+need+for+integrating+genetics+and+genomics.">Next-generation biological control: the need for integrating genetics and genomics.</a> Biol Rev Camb Philos Soc. 95 (6), 1838-1854 (2020).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Leonard, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+symbionts+activate+honey+bee+immunity+and+limit+pathogens.">Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens.</a> Science. 367 (6477), 573-576 (2020).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+an+essential+gene+involved+in+infestation+and+digestion+in+grain+aphid+through+plant-mediated+RNA+interference+generates+aphid-resistant+wheat+plants.">Silencing an essential gene involved in infestation and digestion in grain aphid through plant-mediated RNA interference generates aphid-resistant wheat plants.</a> Plant Biotechnol J. 17 (5), 852-854 (2019).</li><li>Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+Microinjection+and+Transplantation+Technique+for+Nasonia+vitripennis+Genome+Manipulation.">Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation.</a> J Vis Exp. 130, e56990 (2017).</li><li>Dalla Benetta, E., Chaverra-Rodriguez, D., Rasgon, J. L., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pupal+and+Adult+Injections+for+RNAi+and+CRISPR+Gene+Editing+in+Nasonia+vitripennis.">Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis.</a> J Vis Exp. 166, e61892 (2020).</li><li>Lynch, J. A., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+parental+RNA+interference+in+the+wasp+Nasonia+vitripennis.">A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis.</a> Nat Protoc. 1 (1), 486-494 (2006).</li><li>Zhu, K. Y., Palli, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms,+Applications,+and+Challenges+of+Insect+RNA+Interference.">Mechanisms, Applications, and Challenges of Insect RNA Interference.</a> Annu Rev Entomol. 65, 293-311 (2020).</li><li>Colinet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+RNAi+in+a+Drosophila+endoparasitoid+wasp+and+demonstration+of+its+efficiency+in+impairing+venom+protein+production.">Development of RNAi in a Drosophila endoparasitoid wasp and demonstration of its efficiency in impairing venom protein production.</a> J Insect Physiol. 63, 56-61 (2014).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+digestive+tract+expressing+&#945;-amylase+influences+the+adult+lifespan+of+Pteromalus+puparum+revealed+through+RNAi+and+rescue+analyses.">A digestive tract expressing &#945;-amylase influences the adult lifespan of Pteromalus puparum revealed through RNAi and rescue analyses.</a> Pest Manag Sci. 75 (12), 3346-3355 (2019).</li><li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia-infected+Trichogramma+dendrolimi+is+outcompeted+by+its+uninfected+counterpart+in+superparasitism+but+does+not+have+developmental+delay.">Wolbachia-infected Trichogramma dendrolimi is outcompeted by its uninfected counterpart in superparasitism but does not have developmental delay.</a> Pest Manag Sci. 79 (3), 1005-1017 (2023).</li><li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posterior+concentration+of+Wolbachia+during+the+early+embryogenesis+of+the+host+dynamically+shapes+the+tissue+tropism+of+Wolbachia+in+host+Trichogramma+wasps.">Posterior concentration of Wolbachia during the early embryogenesis of the host dynamically shapes the tissue tropism of Wolbachia in host Trichogramma wasps.</a> Front Cell Infect Microbiol. 13, 1198428 (2023).</li><li>Lee, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Trichogramma+evanescens+Westw.+and+its+influence+on+the+embryonic+development+of+its+host,+Attacus+cynthia+ricini+Boisd.">The development of Trichogramma evanescens Westw. and its influence on the embryonic development of its host, Attacus cynthia ricini Boisd.</a> Acta Entomol Sin Z. 11 (1), 89-119 (1961).</li><li>Shen, Y., Chen, Y. Z., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi-mediated+silencing+of+genes+in+the+brown+planthopper+Nilaparvata+lugens+affects+survival,+growth+and+female+fecundity.">RNAi-mediated silencing of genes in the brown planthopper Nilaparvata lugens affects survival, growth and female fecundity.</a> Pest Manag Sci. 77 (1), 365-377 (2021).</li><li>Wu, S., Yin, S., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+physiology+of+iron+trafficking+in+Drosophila+melanogaster.">Molecular physiology of iron trafficking in Drosophila melanogaster.</a> Curr Res Insect Sci. 50, 100888 (2022).</li><li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia-Driven+Memory+Loss+in+a+Parasitic+Wasp+Increases+Superparasitism+to+Enhance+Horizontal+Transmission.">Wolbachia-Driven Memory Loss in a Parasitic Wasp Increases Superparasitism to Enhance Horizontal Transmission.</a> mBio. 13 (6), e0236222 (2022).</li><li>Ning, S. F., Zhou, J. C., Liu, Q. Q., Zhao, Q., Dong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradual,+temperature-induced+change+of+secondary+sexual+characteristics+in+Trichogramma+pretiosum+infected+with+parthenogenesis-inducing+Wolbachia.">Gradual, temperature-induced change of secondary sexual characteristics in Trichogramma pretiosum infected with parthenogenesis-inducing Wolbachia.</a> PeerJ. 7, e7567 (2019).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+Wolbachia+titers+cause+gradual+change+in+masculinization+of+intersex+individuals+of+thelytokous+Trichogramma+dendrolimi.">Decreased Wolbachia titers cause gradual change in masculinization of intersex individuals of thelytokous Trichogramma dendrolimi.</a> Entomol Gen. 42 (5), 751-759 (2022).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-parasitism:+A+promising+approach+to+simultaneously+produce+Trichogramma+chilonis+and+T.+dendrolimi+on+eggs+of+Antheraea+pernyi.">Multi-parasitism: A promising approach to simultaneously produce Trichogramma chilonis and T. dendrolimi on eggs of Antheraea pernyi.</a> Entomol Gen. 41 (6), 627-636 (2021).</li><li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Thelytokous+parthenogenesis-inducing+Wolbachia+on+the+fitness+of+Trichogramma+dendrolimi+Matsumura+(Hymenoptera:+Trichogrammatidae)+in+superparasitised+and+single-parasitised+hosts.">Effects of Thelytokous parthenogenesis-inducing Wolbachia on the fitness of Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) in superparasitised and single-parasitised hosts.</a> Front Ecol Evol. 9, 730664 (2021).</li><li>Flanders, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notes+on+the+life+history+and+anatomy+of+Trichogramma.">Notes on the life history and anatomy of Trichogramma.</a> Ann Entomol Soc Am. 30 (2), 304-308 (1937).</li></ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

As vespas Trichogramma são reconhecidas como agentes eficazes de controle biológico, visando especificamente uma variedade de pragas de lepidópteros na agricultura e silvicultura1. Essas vespas diminutas passam por seus estágios imaturos dentro do ovo hospedeiro, característica que apresenta desafios na condução de experimentos com RNAi 5,18. Este estudo oferece um guia visual abrangente para a realização de experimentos ...

Trichogramma spp é um grupo de parasitoides de ovos que tem sido extensivamente utilizado como agentes de controle biológico altamente eficientes contra um amplo espectro de lepidópteros pragas em ecossistemas agrícolas e florestais em todo o mundo 1,2,3,4. A aplicação de Trichogramma criado em massa proporciona uma abordagem ambientalmente correta para o manejo sustentável de pragas 5,6,7. A compreensão da biologia molecular de vespas Trichogramma fornece informações valiosas para aumentar a eficiência de criação em massa e o desempenho em campo desses agentes de controle biológico 8,9, investigando a metodologia de regulação gênica e edição do genoma10.
Desde a descoberta da interferência genética específica mediada por RNA de fita dupla (dsRNA) em Caenorhabditis elegans em 1998, o método de interferência de RNA (RNAi) evoluiu para um kit de ferramentas genético vital para explorar os mecanismos regulatórios de organismos suprimindo a expressão de genes-alvo11. Experimentos com RNAi tornaram-se uma metodologia padrão amplamente aplicada para estudar a função gênica em inúmeras espécies de insetos12,13. No entanto, a manipulação de RNAi representa um formidável desafio em muitas espécies de parasitoides, particularmente naquelas pertencentes à família endoparasitária Chalcidoidea14,15,16. O método RNAi foi documentado em pelo menos 13 espécies de parasitoides 14,15,16,17,18,19. Dentre estas, a abordagem RNAi tem sido amplamente conduzida em vespas Nasonia e é aplicável em todos os estágios de desenvolvimento, incluindo embriões, larvas, pupas e adultos 14,15,16. Vale ressaltar que as vespas Nasonia são ectoparasitóides, com seus filhotes se desenvolvendo no espaço intersticial entre a pupa hospedeira e o pupário, possibilitando seu cultivo in vitro e fazendo-os tolerar certos tratamentos, como a microinjeção. Ao contrário das vespas Nasonia, os indivíduos de Trichogramma passam por todo o seu desenvolvimento embrionário, larval e pupal dentro do ovo hospedeiro. A camada nos estágios embrionário e larval (que pode impedir a permeabilidade ao dsRNA), a vulnerabilidade a danos e a dificuldade de sobrevivência in vitro apresentam obstáculos formidáveis 20,21,22. Além disso, o tamanho diminuto dos indivíduos de Trichogramma, aproximadamente ~0,5 mm no comprimento adulto ou pupal, torna-os extremamente intrincados para manipular20,21,22.
No presente estudo, delineamos um procedimento abrangente para a realização de experimentos de RNA de interferência (RNAi) em Trichogramma denrolimi Matsumura. Esse procedimento engloba os seguintes procedimentos: (1) o planejamento e síntese de RNA de fita dupla (dsRNA), (2) microinjeção de pupas de T. denrolimi, (3) o transplante e incubação in vitro dessas pupas e (4) a detecção de knockdown do gene alvo por meio da análise de RT-qPCR. O gene alvo selecionado para o experimento RNAi é a homologia da cadeia pesada de ferritina (Ferhch). FerHCH, uma proteína ligadora de ferro, contém um centro de ferroxidase dotado de capacidades antioxidantes, facilitando a oxidação de Fe2+ a Fe3+. Desempenha um papel indispensável no crescimento e desenvolvimento de vários organismos, mantendo o equilíbrio redox e a homeostase do ferro. A depleção de FerHCH pode resultar no acúmulo excessivo de ferro, levando a danos teciduais irreversíveis e, muitas vezes, culminando em alterações fenotípicas significativas, incluindo defeitos de crescimento, deformidades e mortalidade23,24. Este estudo oferece um guia passo-a-passo para a condução de RNAi em T. denrolimi, que será inestimável para investigar as funções gênicas dentro do contexto mais amplo de vespas Trichogramma.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2x ES Taq MasterMix (Dye)</td>
			<td>Cowin Biotech, China</td>
			<td>CW0690H</td>
			<td>To amplify the dsRNA sequences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x PBS Buffer, DEPC treated (7.2-7.6)</td>
			<td>Sangon Biotech, China</td>
			<td>B540627-0500</td>
			<td>To dilute dsRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar strip</td>
			<td>Shishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, China</td>
			<td>n/a</td>
			<td>To make culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium</td>
			<td>Sangon Biotech, China</td>
			<td>A610028</td>
			<td>To make culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioer Constant temperature metal bath&#160;</td>
			<td>BIOER, China</td>
			<td>MB-102</td>
			<td>To synthesis dsRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary&#160;</td>
			<td>WPI, USA</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td>To pull capillary glass needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean bench&#160;</td>
			<td>Airtech, China</td>
			<td>SW-CJ-1FD</td>
			<td>To extract RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double distilled water</td>
			<td>Sangon Biotech, China</td>
			<td>A500197-0500</td>
			<td>To dilute cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental Testing chamber&#160;</td>
			<td>Panasonic, Japan</td>
			<td>MLR-352H-PC</td>
			<td>To culture T. denrolimi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendrof, Germany</td>
			<td>5418R</td>
			<td>To store RNA content</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf FemtoJet 4i</td>
			<td>Eppendrof, Germany</td>
			<td>FemtoJet 4i</td>
			<td>To inject T. denrolimi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Refrigerated Centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendrof, Germany</td>
			<td>5810R</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol solution (75%, RNase-free)</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>M052131-500ml</td>
			<td>To extract RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Extraction Kit</td>
			<td>Omega, USA</td>
			<td>D25000-02</td>
			<td>To extract cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GUM Arabic</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>CG5991-500g</td>
			<td>To make egg card</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alchohol</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>80109218</td>
			<td>To extract RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-Based Micropipette Puller&#160;</td>
			<td>SUTTER, USA</td>
			<td>P-2000</td>
			<td>To pull capillary glass needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader&#160;</td>
			<td>Eppendrof, Germany</td>
			<td>20 &#181;L</td>
			<td>To load dsRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-sample tissue grinder&#160;</td>
			<td>LICHEN, China</td>
			<td>LC-TG-24</td>
			<td>To grind T. denrolimi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Grinder&#160;</td>
			<td>SUTTER, USA</td>
			<td>BV-10-E</td>
			<td>To grind capillary glass needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Sangon Biotech, China</td>
			<td></td>
			<td>To dilute RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OLYMPUS Microscope</td>
			<td>OLYMPUS, Japan</td>
			<td>XZX16</td>
			<td>To observe T. denrolimi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine&#160;</td>
			<td>Bio-rad, USA</td>
			<td>S-1000</td>
			<td>For DNA amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic</td>
			<td>Bio-rad, USA</td>
			<td>PowerPacTM Basic</td>
			<td>To detect the quality of dsRNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer of dsGFP (Forward)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[TAATACGACTCACTATAGGG] 
			ACAAACCAAGGCAAGTAATA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer of dsGFP (Reverse)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[TAATACGACTCACTATAGGG] 
			CAGAGGCATCTTCAACG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer of Ferhch for qPCR (Forward)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer of Ferhch for qPCR (Reverse)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer of Ferhch for RNAi (Reverse)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[TAATACGACTCACTATAGGG]AG 
			TAGCCATCATCTTTCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer of Ferhch for RNAi(Forward)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[TAATACGACTCACTATAGGG] 
			ACACTGTCAATCGTCCTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer of FoxO for qPCR (Forward)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CTACGCCGATCTCATAACGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer of FoxO for qPCR (Reverse)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TGCTGTCGCCCTTGTCCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)</td>
			<td>TaKaRa, Japan</td>
			<td>RR047A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantitative Real-time PCR&#160;</td>
			<td>Bio-rad, USA</td>
			<td>CFX 96 Touch</td>
			<td>To perform reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR (TaqMan) Primer and Probes Design Tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RiBoMAX Express RNAi System</td>
			<td>Promega, USA</td>
			<td>P1700</td>
			<td>To synthesis dsRNA &#160;in vitro&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Green Premix Ex TaqTM <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66250/66250eq01.jpg" style="margin: auto;" /> (Til RnaseH Plus)</td>
			<td>TaKaRa, Japan</td>
			<td>RR820A</td>
			<td>To perform RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloromethane</td>
			<td>KESHI, China</td>
			<td>GB/T682-2002</td>
			<td>To extract RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Ambion, USA</td>
			<td>15596018</td>
			<td>To extract total RNA content from samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low Temperature Freezer&#160;</td>
			<td>Thermo, USA</td>
			<td>Forma 911</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna interference in the egg parasitoid, trichogramma dendrolimi matsumura

Os parasitoides de ovos, Trichogramma spp, são reconhecidos como eficientes agentes de controle biológico contra diversas pragas de lepidópteros na agricultura e florestas. Os estágios imaturos da prole de Trichogramma desenvolvem-se dentro do ovo hospedeiro, exibindo notável diminuividade (aproximadamente 0,5 mm de comprimento adulto). A metodologia de RNA-interferência (RNAi) tem emergido como uma ferramenta crucial para elucidar funções gênicas em inúmeros organismos. No entanto, a manipulação de RNAi em certas espécies de pequenos parasitoides, como Trichogramma, tem geralmente representado desafios significativos. Neste estudo, apresentamos um método RNAi eficiente em Trichogramma denrolimi. O procedimento delineado abrange a aquisição e o isolamento de espécimes individuais de T. dendrolimi a partir de ovos hospedeiros, o planejamento e a síntese de RNA de fita dupla (dsRNA), o transplante e cultivo in vitro de pupas de T. dendrolimi , a microinjeção de dsRNA e a subsequente avaliação do knockdown do gene alvo através da análise de RT-qPCR. Este estudo fornece um procedimento abrangente e visualmente detalhado para a realização de experimentos de RNAi em T. dendrolimi, permitindo que os pesquisadores investiguem a regulação gênica nesta espécie. Além disso, esta metodologia é adaptável para estudos de RNAi ou micro-injeções em outras espécies de Trichogramma com pequenos ajustes, tornando-se uma referência valiosa para a realização de experimentos de RNAi em outras espécies endoparasitárias.

Trichogramma spp. are a group of egg parasitoids that have been extensively utilized as highly efficient biological control agents against a wide spectrum of lepidopteran pests in agricultural and forest ecosystems worldwide1,2,3,4. The application of mass-reared Trichogramma provides an environmentally friendly approach for the sustainable management of pests5,6,7. Understanding the molecular biology of Trichogramma wasps provides valuable insights into enhancing the mass-rearing efficiency and field performance of these biological control agents8,9by investigating the methodology of gene regulation and genome editing10.
Since the discovery of double-stranded RNA (dsRNA)-mediated specific genetic interference in Caenorhabditis elegans in 1998, the RNA-interference (RNAi) method has evolved into a vital genetic toolkit for exploring the regulatory mechanisms of organisms by suppressing the expression of target genes11. RNAi experiments have become a standard methodology widely applied to study gene function in numerous insect species12,13. Nevertheless, the manipulation of RNAi presents a formidable challenge in many parasitoid species, particularly among those belonging to the endoparasitic Chalcidoidea family14,15,16. The RNAi method has been documented in at least 13 parasitoid species14,15,16,17,18,19. Among these, the RNAi approach has been comprehensively conducted in Nasonia wasps and is applicable throughout the developmental stages, including embryos, larvae, pupae, and adults14,15,16. It is noteworthy that Nasonia wasps are ectoparasitoids, with their offspring developing in the interstitial space between the host pupa and the puparium, enabling their cultivation in vitro and making them tolerate certain treatments, such as micro-injection. Unlike Nasonia wasps, Trichogramma individuals undergo their entire embryonic, larval, and pupal development inner the host egg. The layer at embryo and larva stages (which may impede dsRNA permeability), vulnerability to damage, and the difficulty in surviving in vitro present formidable obstacles20,21,22. Additionally, the diminutive size of Trichogramma individuals, approximately ~0.5 mm in adult or pupal length, renders them exceedingly intricate to manipulate20,21,22.
In the present study, we outline a comprehensive procedure for conducting RNA interference (RNAi) experiments in Trichogramma denrolimi Matsumura. This procedure encompasses the following procedures: (1) the design and synthesis of double-stranded RNA (dsRNA), (2) microinjection of T. denrolimi pupae, (3) the transplantation and in vitro incubation of these pupae, and (4) the detection of target gene knockdown through RT-qPCR analysis. The target gene selected for the RNAi experiment is the ferritin heavy chain homology (Ferhch). FerHCH, an iron-binding protein, contains a ferroxidase center endowed with antioxidant capabilities, facilitating the oxidation of Fe2+ to Fe3+. It plays an indispensable role in the growth and development of various organisms by maintaining redox equilibrium and iron homeostasis. Depletion of FerHCH can result in the overaccumulation of iron, leading to irreversible tissue damage, and often culminating in significant phenotypic alterations, including growth defects, deformities, and mortality23,24. This study offers a step-by-step guide for conducting RNAi in T. denrolimi, which will be invaluable for investigating the gene functions within the broader context of Trichogramma wasps.

Autor em destaque: Investigando a partenogênese Thelytokous induzida por Wolbachia e o desenvolvimento do kit de ferramentas genéticas por meio da interferência de RNA

Interferência de RNA no parasitoide de ovos, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Trichogramma wasps are a group of egg parasitoids used to control lepidopteran pests in agriculture. The intracellular bacteria Wolbachia induces thelytokous parthenogenesis in some Trichogramma wasps. We are trying to answer the mechanism of Wolbachia and sex-determination systems in Trichogramma wasps.We have developed the RNA interference method in Trichogramma wasps. This method is a vital genetic toolkit for investigating the gene functions of Trichogramma. The immature stages of Trichogramma offspring develop within the host egg.The body size of Trichogramma is extremely small and is approximately 0.5 millimeter in adult length. The manipulation of genetic tools such as RNA interference and genome editing presents a formidable challenge for these tiny parasitoid wasps. For decades, gene functions within the entire Trichogramma genus have been rarely explored.The present methodology provides a robust model for investigating gene regulation during developmental and physiological activities in Trichogramma wasps.

A taxa de emergência de pupas de T. denrolimi injetadas com dsFerhch foi significativamente menor do que a daquelas injetadas com dsGFP ou sem injeção (Tabela 1). Entre as vespas emergidas, 51,85% das vespas T. denrolimi submetidas a dsFerhch desenvolveram pequenas asas deformadas. As vespas deformadas não foram observadas nas vespas injetadas com dsGFP ou sem qualquer injeção (Tabela 1). Além disso, o abdome de pupas de T....

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A manipulação de RNA de interferência (RNAi) apresenta um formidável desafio em muitas espécies de parasitoides com tamanho diminuto, como as vespas Trichogramma . Este estudo delineou um método RNAi eficiente em Trichogramma denrolimi. A presente metodologia fornece um modelo robusto para investigar a regulação gênica em vespas Trichogramma .

The egg parasitoids, Trichogramma spp, are recognized as efficient biological control agents against various lepidopteran pests in agriculture and ...

Vespas Trichogramma são um grupo de parasitoides de ovos utilizados no controle de lepidópteros pragas na agricultura. A bactéria intracelular Wolbachia induz partenogênese telítoka em algumas vespas Trichogramma. Estamos tentando responder o mecanismo da Wolbachia e os sistemas de determinação do sexo em vespas Trichogramma.Desenvolvemos o método de interferência de RNA em vespas Trichogramma. Este método é um kit de ferramentas genéticas vital para investigar as funções gênicas de Trichogramma. Os estágios imaturos da prole de Trichogramma desenvolvem-se dentro do ovo hospedeiro.O tamanho do corpo de Trichogramma é extremamente pequeno e é de aproximadamente 0,5 milímetro no comprimento adulto. A manipulação de ferramentas genéticas como interferência de RNA e edição do genoma apresenta um desafio formidável para essas minúsculas vespas parasitoides. Durante décadas, as funções gênicas dentro de todo o gênero Trichogramma foram raramente exploradas.A presente metodologia fornece um modelo robusto para investigar a regulação gênica durante atividades fisiológicas e de desenvolvimento em vespas Trichogramma.

rna-interference-egg-parasitoid-trichogramma-dendrolimi

Research

JoVE Journal

Biology

RNA Interference in the Egg Parasitoid, Trichogramma dendrolimi Matsumura

1.0K visualizações.  Shenyang Agricultural University. Vespas Trichogramma são um grupo de parasitoides de ovos utilizados no controle de lepidópteros pragas na agricultura. A bactéria intracelular Wolbachia induz partenogênese telítoka em algumas vespas Trichogramma. Estamos tentando responder o mecanismo da Wolbachia e os sistemas de determinação do sexo em vespas Trichogramma.Desenvolvemos o método de interferência de RNA em vespas Trichogramma. Este método é um kit de ferramentas genéticas vital para investigar as funções...

Vídeo: Autor em destaque: Investigando a partenogênese Thelytokous induzida por Wolbachia e o desenvolvimento do kit de ferramentas genéticas por meio da interferência de RNA

The egg parasitoids, Trichogramma spp, are recognized as efficient biological control agents against various lepidopteran pests in agriculture and forests. The immature stages of Trichogramma offspring develop within the host egg, exhibiting remarkable diminutiveness (approximately 0.5 mm in adult length). RNA-interference (RNAi) methodology has emerged as a crucial tool for elucidating gene functions in numerous organisms. However, manipulating RNAi in certain small parasitoid species, such as Trichogramma, has generally posed significant challenges. In this study, we present an efficient RNAi method in Trichogramma denrolimi. The outlined procedure encompasses the acquisition and isolation of individual T. dendrolimi specimens from host eggs, the design and synthesis of double-stranded RNA (dsRNA), the in vitro transplantation and cultivation of T. dendrolimi pupae, the micro-injection of dsRNA, and the subsequent assessment of target gene knockdown through RT-qPCR analysis. This study furnishes a comprehensive, visually detailed procedure for conducting RNAi experiments in T. dendrolimi, thereby enabling researchers to investigate the gene regulation in this species. Furthermore, this methodology is adaptable for RNAi studies or micro-injections in other Trichogramma species with minor adjustments, rendering it a valuable reference for conducting RNAi experiments in other endoparasitic species.

The manipulation of RNA interference (RNAi) presents a formidable challenge in many parasitoid species with diminutive size, such as Trichogramma wasps. This study delineated an efficient RNAi method in Trichogramma denrolimi. The present methodology provides a robust model for investigating gene regulation in Trichogramma wasps.

Biologia

Cultivation and Transplantation of Trichogramma dendrolimi Pupae Using Corcyra cephalonica Eggs

To begin, add a solution of gum Arabic powder and water to a nine centimeter by 16 centimeter card. Then place approximately 5, 000 eggs of Corcyra cephalonica onto the card. Subject the host egg cards to 30 minutes of ultraviolet irradiation to prevent the hatching of eggs.Subsequently, cut the paper with inactivated eggs into egg cards, each containing approximately 300 to 500 eggs. Next, introduce a cohort of 80 to 120 Trichogramma dendrolimi wasps into a glass tube. Seal the tube with cotton.For parasitization, allow the wasps to deposit their eggs into the host eggs for six hours. Then promptly remove the wasps. Cultivate the parasitized host eggs for approximately eight days at 25 degrees Celsius.After five days, the parasitized host eggs turned black. Transfer the host egg card to a dissecting microscope. Using a pair of tungsten needles, meticulously remove the chorion from the host eggs and retrieve the pupa from within.Next, prepare a plate with 1.5%agar as substrate. Using a disinfected graver, etch several grooves on the agar. Now using a small brush, transplant a pupa from the dissected host egg into one of the grooves on the agar substrate.

Cultivo e Transplante de Pupas de Trichogramma dendrolimi Utilizando Ovos de Corcyra cephalonica

Microinjecting dsRNA into Trichogramma dendrolimi Pupae and Monitoring Developmental Outcomes

To begin, turn on the glass needle puller, then set the heat to 280, the velocity to 170, the delay to 250, and the pole to 30. Bevel the tip of the capillary glass needle. Then using a micro injection pump, load approximately two microliters of ferritin heavy chain homology double-stranded RNA solution into the injection needle.Transfer the agar plate containing Trichogramma dendrolimi pupae onto the compound microscope stage. Carefully insert the injection needle into the abdomen of a pupa at an approximately 30 degree angle and gradually inject five nanoliters of ferritin heavy chain homology double-stranded RNA solution. Incubate approximately 700 pupae per treatment at 25 degrees Celsius for 24 or 48 hours.Extract RNA content from 100 pupae per replicate. From approximately 50 pupae per treatment, observe the wasps emergence. Finally, record the wasps emergence rate and deformity rate.T.dendrolimi pupae injected with double-stranded ferritin heavy chain homology exhibited a significantly lower emergence rate compared to those injected with double-stranded GFP or without injection. In emerged wasps, 51.85%of T.dendrolimi wasps subjected to double-stranded ferritin heavy chain homology developed deformed small wings. This deformation was absent in wasps injected with double-stranded GFP or those without any injection.Additionally, T.dendrolimi pupae injected with double-stranded ferritin heavy chain homology showed melanism, indicative of abnormal iron metabolism. The melanin was not observed in wasps injected with double-stranded GFP or those without any injection.