NINDS concede NS49720 e NS65819 e NCI conceder CA97257

1. Preparação de células tumorais. Células para xenotransplantes tumorais do cérebro humano pode ser obtida quer a partir de tumores propagada como crescimentos subcutânea em camundongos atímicos, ou de cultura de células. Utilização de ambas as fontes de células é discutido abaixo, juntamente com a demonstração de um método para implante de células. Para preparar células de tumores subcutâneos para transferência para o compartimento intracraniano, tumor extirpado flanco são colocados em placas de cultura, onde o tecido é inicialmente picada com um bisturi e, em seguida mecanicamente interrompidos por pipetagem repetitiva para criar uma suspensão total de células 1. A suspensão total da célula é então passado através de uma malha de nylon 70 mM filtro para produzir uma suspensão de células único adequado para injeção intracraniana. A suspensão celular é centrifugado a 1000 rpm por 10 minutos a 4 ° C, eo sobrenadante aspirado antes de ressuspender o pellet celular em um volume adequado de soro livre de mídia para obter uma concentração de trabalho final (veja abaixo). Para preparar linhas celulares estabelecidas para a implantação intracraniana, as células são colhidas por monocamadas trypsinizing, ou através da recolha de culturas em suspensão neurosphere, seguida de centrifugação e ressuspensão das células conforme indicado acima 2. O número de células injetadas é variável dependente da localização neuroanatômica da injeção. Para injectáveis ​​supratentorial rotineiramente injetar 3-5 x 10 5 células em 3 mL de soro livre de media (DMEM), enquanto que para brainstem injeções 3, sómente 5 x 10 4 células são injetadas em 0,5 mL. Injetando volumes maiores do que o recomendado pode resultar em refluxo de células tumorais através do trato agulha, com exofíticas resultante (Figura 1), em vez de o crescimento do tumor intracraniano. Após a retirada de amostra para injeção intracraniana, a suspensão de células restantes devem ser colocados no gelo, com conteúdo misturado com freqüência para manter a concentração adequada ao completar estabelecimento tumor intracraniano entre os membros de uma série de injeção. 2. O implante de células tumorais Note, todos os procedimentos descritos abaixo foram analisados ​​e aprovados pelo Uso de Animais Institucional e Comitê de Cuidados na Universidade da Califórnia em San Francisco. <ol><li> A área cirúrgica deve ser preparado por pulverização todas as superfícies com um desinfectante, como solução de clorexidina 2%. Depois de usar o desinfetante, o seguinte material deve ser colocado na área cirúrgica: <ul><li> Almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal do rato </li><li> Duas pequenas placas de Petri, um contendo peróxido de hidrogênio 3% e uma contendo clorexidina a 2% </li><li> Swabs estéreis gaze e algodão </li><li> Estéril bisturis descartáveis </li><li> Grampeador cirúrgico autoclavado </li></ul></li><li> Para anestesia um anestésico injetado deve ser usado, normalmente uma mistura de cetamina-xilazina. </li><li> Uma vez que um rato é anestesiado, o couro cabeludo é preparada limpando várias vezes com um pedaço de gaze estéril embebida em solução de clorexidina. Pomada deve ser aplicada para manter a umidade adequada durante o procedimento. Utilizando um escalpelo esterilizado, completa uma incisão sagital sobre o osso parieto-occipital, cerca de um centímetro de comprimento. A superfície exposta do crânio é então limpo com um cotonete embebido em uma solução de 3% de peróxido de hidrogênio. O bregma deve ser aparente neste ponto (ver vídeo). </li><li> As coordenadas para injeção de células tumorais irá variar de acordo com o site desejado para o estabelecimento tumor. A seguir representa o processo que usamos para o estabelecimento tumor intracerebral 2 em uma localização neuroanatômica em que pacientes com tumor cerebral muitas experiência em desenvolvimento de tumor. Outros locais de interesse em pesquisa tumor no cérebro incluem a ponte, para a modelagem anatômica do tronco cerebral tumores 3, e injeções subdural para a modelagem de localização de tumores das meninges 4. Antes da injeção das células tumorais, use uma agulha estéril 25 afiada para perfurar o crânio de 2 mm à direita do bregma e 1 mm anterior à sutura coronal, criando assim uma abertura para a injeção de células tumorais (ver vídeo). Este procedimento funciona bem para ambos os camundongos e ratos (22 agulha para ratos). </li><li> Antes da elaboração células dentro da seringa, misture o conteúdo da suspensão celular tocando com o dedo. Carregar a seringa com a quantidade desejada de suspensão celular, tomando cuidado para evitar a criação de bolhas de ar. A parte externa da seringa deve ser limpo com um algodão embebido em álcool para limpar o exterior livre de quaisquer células aderentes, o que ajudará a prevenir estabelecimento tumor extra e crescimento (Figura 1A). Para garantir que a profundidade de injeção adequado é atingido, usar um bisturi para cortar três milímetros fora da ponta de uma ponta pipetteman P20. Esta seção da ponta pode ser colocada sobre a seringa e vai agir para limitar a profundidade da injeção, e ainda irá garantir que a tip da agulha da seringa é 3mm da parte inferior do crânio. Coloque a seringa perpendicular ao crânio e no buraco criado anteriormente, e injecte lentamente a suspensão de células (uma suspensão 3μL deve ser injectado ao longo de um período de 1 minuto). Um ângulo inadequado de inserção seringa pode resultar em injeção intraventricular de células e disseminação da coluna posterior (Fig. 1B: Direita) Ao completar a injecção, deixe a agulha no lugar por mais um minuto, em seguida, lentamente retirar (ver vídeo): estes passos ajudará a reduzir refluxo de células tumorais. </li><li> Como uma alternativa para a abordagem sem ajuda ou free-mão para implante de células do tumor intracraniano 5, pode-se usar uma moldura estereotáxica pequeno animal (F painel de visão geral esquemática), que geralmente promove local de injeção mais consistente, mas à custa de quantidades substanciais de tempo processual. Em nossa experiência, dois equipe cirúrgica pode injetar cerca de 60 ratos / hora quando se utiliza a abordagem à mão livre, que a taxa máxima de injeção com um quadro de pequenos animais estereotáxica é de aproximadamente 15 ratos / hora. Expediente processual é uma consideração importante ao injetar grandes séries de ratos, e ajuda a reduzir o tempo em que as células tumorais, a ser injetado, são deixados no gelo. </li><li> Limpe o crânio com peróxido de hidrogênio 3% e seco com um cotonete estéril seco. Aplicar cera de osso estéril para o buraco. Usando uma pinça, tirar o couro cabeludo em conjunto sobre o crânio e grampos para fechar. Para a cura ideal, o couro cabeludo deve ser grampeado com a derme de cada lado do couro cabeludo contra os outros (baixo contra baixo). O couro cabeludo grampeado deve ser limpo com solução de clorexidina, e buprenorfina, em seguida, administradas por injecção subcutânea no pós-operatório alívio da dor. </li><li> Monitorar todos os ratos pós-operatório até que se tornem ambulantes e manter atividade normal. Normalmente, o tempo de recuperação é de cerca de 30 minutos. </li></ol> 3. Monitoramento bioluminescência do crescimento tumoral <ol><li> Fundo. Imagem de bioluminescência (BLI) é baseado na oxidação da luciferina [d-(-) -2 - (60-hidroxi-20-benzothiazolyl)-thiazone-4-carboxílico] na presença de oxigênio e trifosfato de adenosina (ATP). Esta reação é catalisada pela enzima luciferase, que converte energia química em fótons com emissão resultante da luz. Células humanas podem ser modificados para expressar luciferase (veja abaixo), com apenas luciferase células que expressam capaz de emitir luz na presença do substrato luciferina. Há luminescência de fundo mínimo de animais tratados com hosts luciferina, de modo que há uma muito favorável relação sinal-ruído para detectar as emissões de luminescência da luciferase modificados células tumorais, permitindo o monitoramento altamente sensível do crescimento do tumor e resposta terapêutica in vivo. Além disso, luciferase e seu substrato, a luciferina, foram mostrados para ser não-tóxico para células de mamíferos, e temos observado nenhuma diferença funcional entre células que expressam em relação a luciferase correspondentes células não modificado. Luciferina atravessa facilmente as membranas celulares e da barreira hemato-encefálica após intraperitoneal (ip) ou injecção intravenosa (iv) em ratos, permitindo que imagens de cada compartimento que contém luciferase modificados células. O nível de emissão de fótons e do espectro da luz emitida luciferase modificados células é suficiente para penetrar nos tecidos de animais de pesquisa de pequeno porte, como camundongos e ratos, e pode ser detectado externamente com câmeras de baixa luminosidade de imagem. O caráter não-invasivo de imagem de bioluminescência permite a monitorização repetida de crescimento do tumor e resposta terapêutica em indivíduos animal individual. </li><li> Fontes de células devem ser implantadas de forma estável modificado para firefly expressão luciferase. Como fontes de células podem ser comprados ou produzidos em laboratórios individuais usando lentivírus que foram construídos para a expressão constitutiva da luciferase. Recomendamos fortemente o uso de células modificadas com lentivírus codificação luciferase, em vez de plasmídeo, para garantir a expressão celular estável de luciferase in vivo, que é necessário para imagens de luminescência quantitativa para fornecer indicação precisa de mudanças na carga tumoral para assuntos individuais dos animais que são repetidamente imaged durante o curso de um experimento. </li><li> Monitoramento BLI. Recomendamos a realização de imagem de bioluminescência quantitativos (qBLI) 1x-2x por semana, começando uma semana após a injeção das células tumorais. Nosso qBLI seja efectuada utilizando os IVIS Lumina imagem estação (Caliper Life Sciences), e nossos resultados indicam dados semelhantes são obtidos em usar o Lumina IVIS, o IVIS 150, ou o IVIS estação de imagens 200. Em preparação para a imagem latente, os ratos são, simultaneamente, anestesiados com cetamina / xilazina e luciferina administrados (D-Luciferina sal de potássio, 150 mg / kg, Caliper Life Sciences), através de injeção intraperitoneal, com camundongos imaged 12 minutos após a injeção. A farmacocinética da luciferina indicam que o tempo entre a administraçãoconcentração de luciferina e determinação da luminescência célula deve ser entre 10-15 minutos após a injeção de luciferina, a fim de obter de emissão de luminescência máxima e maior sensibilidade de detecção. O período de tempo selecionados dentro do intervalo de tempo de 10-15 minutos deve ser mantida o mais constante entre os animais que estão sendo fotografada. É extremamente importante para manter a consistência no período de tempo entre a injeção de luciferina ea obtenção de leituras de BLI. Regiões de interesse abrangendo a área intracraniana de sinal são definidos usando software Vivendo Imagem (Figura 2), e os photons/s/sr/cm2 total (fótons por segundo por esterradiano por centímetro quadrado) são registados (ver vídeo). </li><li> Análise de dados. Considerando o crescimento do tumor e resposta terapêutica são monitorados em animais individuais, recomendamos os grupos de tratamento de pelo menos 8 para aumentar a certeza estatística de conclusões sobre a resposta do tumor, ou a falta dela, à terapia. Com relação aos resultados apresentando qBLI, as leituras de luminescência são convertidos para valores normalizados dividindo-se luminescência cada rato s, obtidos durante e após a conclusão do esquema terapêutico, com a sua luminescência de pré-tratamento correspondente máxima de leitura 6,7. Para análise de sobrevivência, o estimador Kaplan-Meier 8 é usado, ea partir do qual as curvas de sobrevivência são gerados, e os valores médio de sobrevida determinada. Diferenças entre as curvas de sobrevida são comparadas através de um teste de log-rank 9. </li><li> Recuperação do cérebro para a análise posterior de tumor tratados e não tratados. Após a eutanásia animal, o cérebro do rato deve ser rapidamente retirado (ver vídeo), e ou colocado em formol para posterior análise da morfologia do tumor e imuno-histoquímica, ou deveria ser montado em outubro para o congelamento da amostra. </li></ol> 4. Resultados representante No exemplo mostrado na Figura 3A, camundongos que receberam injeção de células de tumor intracraniano foram monitorados por luminescência intracraniana até sucessivos valores de luminescência significa indicou crescimento tumoral progressivo, e em que a terapia foi iniciada tempo (início seta cinza no dia 34: erlotinib administrada diariamente a 150 mg / kg, até a eutanásia necessário). Valores de luminescência para cada rato estão definidas para um valor normalizado de 1 no tempo do início da terapêutica, com leituras de luminescência subseqüentes para cada rato normalizado para o valor final de pré-tratamento de imagem. Como exemplo, um mouse com uma leitura de luminescência finais de pré-tratamento de 2,0 x 10 7 fótons / seg no dia 34, cuja luminescência aumentou para 6,0 x 10 7 fótons / seg no dia 38, teria um dia 38 de luminescência valor normalizado de 3,0. A média de bioluminescência normalizado e correspondente erro padrão para os grupos controle e tratamento são plotados para cada tempo de imagem. Neste exemplo, uma diferença significativa na luminescência normalizado dizer é aparente no primeiro ponto imagem em tempo posterior ao início do tratamento (dia 38), com a diferença de luminescência média de grupo mostrando aumento em momentos subseqüentes. Na maioria dos casos, atividade anti-tumoral de terapia, como indicado por qBLI, é acompanhada por uma diferença significativa na sobrevida correspondente (ie, p &lt;0,05), como é o caso aqui (Figura 3B). Painéis 3C e 3D mostram hematoxilina &amp; eosina adjacentes e anti-EGFR cortes corados de cérebro de camundongo obtido no momento da eutanásia, após a colocação do cérebro ressecado em formalina e posterior inclusão em parafina para corte. <img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Indicações de erros de injeção intracraniana. A) o crescimento do tumor exofítico (extracraniana) (círculo vermelho) pode ser causada por uma injeção muito grande volume, suspensão de células residuais anexado à seringa, ou de retirar a seringa muito rapidamente após a injeção das células tumorais. B) A injeção de células tumorais para os ventrículos pode causar disseminação do tumor espinhal (mouse para a direita), em contraste com adequadamente injetado células tumorais, o sinal para que permaneça no local da injeção (mouse para a esquerda). <img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Representações de calor mapa de imagem de bioluminescência intensidade para ratos representante de controle (esquerda) e tratamento (direita) grupos de um experimento de resposta terapêutica. A imagem viva software pode ser configurado para definir regiões de interesse (círculos vermelhos), ou operadores de instrumento pode definir as regiões de interesse manualmente. Para a utilização de imagens como estas para a construção de figura, recomendamos que o operador de instrumento mostra imagens de mapa de calor usando a mesma faixa de bioluminescência mapa de calor (parte superior da figura), para fornecer uma representação visual do grau de diferença entre a bioluminescência assuntos animal. <img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig3.jpg" alt = &quot;Figura 3&quot; /&gt; Figura 3. Bioluminescência, sobrevivência e análise de tecido tumoral a partir de um experimento no qual a resposta terapêutica é evidente. A Plot) de leituras bioluminescência significa para o controle de ratos e grupo de tratamento, com erro padrão indicado para cada ponto de imagem. B) Gráfico de Sobrevivência para os ratos mesmo, p-valor determinado através da utilização de log-rank 7. C) seção H &amp; E manchada de cérebro de camundongos com tumor. D) seção EGFR manchado. E e F) ampliações de áreas indicadas a partir de painéis C e D, respectivamente, com painel E mostrando coloração negativa para a proteína PTEN supressor de tumor.

<ol>
	<li>Giannini, C., Sarkaria, J. N., Saito, A., Uhm, J. H., Galanis, E., Carlson, B. L., Schroeder, M. A., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+Tumor+EGFR+and+PDGFRA+Gene+Amplifications+Retained+in+an+Invasive+Intracranial+Xenograft+Model+of+GBM.">Patient Tumor EGFR and PDGFRA Gene Amplifications Retained in an Invasive Intracranial Xenograft Model of GBM.</a> Neuro-Oncol. 7, 164-176 (2005).</li><li>Ozawa, T., Wang, J., Hu, L. J., Bollen, A. W., Lamborn, K. R., Deen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+human+glioblastomas+as+xenografts+in+the+brains+of+athymic+rats.">Growth of human glioblastomas as xenografts in the brains of athymic rats.</a> In Vivo. 1, 55-60 (2002).</li><li>Hashizume, R., Ozawa, T., Dinca, E. B., Banerjee, A., Prados, M. D., James, C. D., Gupta, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+brainstem+glioma+xenograft+model+enabled+for+bioluminescence+imaging.">A human brainstem glioma xenograft model enabled for bioluminescence imaging.</a> J Neurooncol. , (2009).</li><li>Baia, G. S., Dinca, E. B., Ozawa, T., Kimura, E. T., McDermott, M. W., James, C. D., VandenBerg, S. R., Lal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orthotopic+skull+base+model+of+malignant+meningioma.">An orthotopic skull base model of malignant meningioma.</a> Brain Pathol. 2, 172-179 (2007).</li><li>Ozawa, T., James, C. D., Van Meir, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Brain+Tumor+Cell+and+Tumor+Tissue+Transplantation+Models.">Human Brain Tumor Cell and Tumor Tissue Transplantation Models.</a> CNS Cancer: Models, Markers, Prognostic Factors, Targets, and Therapeutic Approaches. , 147-162 (2009).</li><li>Sarkaria, J. N., Yang, L., Grogan, P. T., Kitange, G. J., Carlson, B. L., Schroeder, M. A., Galanis, E., Giannini, C., Wu, W., Dinca, E. B., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Molecular+Characteristics+Correlated+with+Glioblastoma+Sensitivity+to+EGFR+Kinase+Inhibition+Through+Use+of+an+Intracranial+Xenograft+Test+Panel.">Identification of Molecular Characteristics Correlated with Glioblastoma Sensitivity to EGFR Kinase Inhibition Through Use of an Intracranial Xenograft Test Panel.</a> Mol. Cancer Ther. 6, 1167-1174 (2007).</li><li>Dinca, E. B., Sarkaria, J. N., Schroeder, M. A., Carlson, B. L., Voicu, R., Gupta, N., Berger, M. S., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+Monitoring+of+Intracranial+Glioblastoma+Xenograft+Response+to+Primary+and+Salvage+Temozolomide+Therapy.">Bioluminescence Monitoring of Intracranial Glioblastoma Xenograft Response to Primary and Salvage Temozolomide Therapy.</a> J. Neurosurg. 107, 610-616 (2007).</li><li>Kaplan, E. L., Meier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-parametric+estimation+from+incomplete+observations.">Non-parametric estimation from incomplete observations.</a> J. Am. Stat. Assoc. 53, 457-481 (1958).</li><li>Peto, R., Peto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymptotically+efficient+rank+invariant+procedures.">Asymptotically efficient rank invariant procedures.</a> J. R. Stat. Soc. Ser. A. Stat. Soc. 135, 185-207 (1972).</li><li>Camphausen, K., Purow, B., Sproull, M., Scott, T., Ozawa, T., Deen, D. F., Tofilon, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+in+vivo+growth+on+human+glioma+cell+line+gene+expression:+convergent+profiles+under+orthotopic+conditions.">Influence of in vivo growth on human glioma cell line gene expression: convergent profiles under orthotopic conditions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 102, 8287-8292 (2005).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Ortotópico (intracraniana) cérebro estabelecimento xenoenxerto tumor fornece um microambiente apropriado 10 para o câncer do SNC de modelagem para ser testado para resposta terapêutica. Este tipo de modelagem, adicionalmente, fornece informações sobre o acesso terapêutica para o cérebro e tumor cerebral, que é criticamente importante para determinar se um agente experimental deve ser avançado para a avaliação de ensaios clínicos em pacientes. Porque a quantidade de tumor intracraniano xenoenxerto não podem ser diretamente medidos, como por pinças, acompanhamento longitudinal do crescimento do tumor intracraniano e resposta à terapia requer não-invasiva por imagem, com a nossa imagem de bioluminescência experiência indica como a abordagem mais prática para os experimentos, cujo principal objectivo está avaliando extensão da resposta do tumor à terapia. Quando os resultados de imagem de bioluminescência são combinados com análise de sobrevida de animais assunto, os dois conjuntos de dados oferecem uma abordagem poderosa e confiável para avaliar a eficácia terapêutica experimental. Finalmente, é extremamente importante que xenoenxertos tumor intracraniano cérebro são colhidos de indivíduos animais sacrificados, a fim de avaliar os efeitos morfológicos e moleculares da terapia, e para isso nós preferimos ressecção cérebro inteiro no momento da eutanásia, com a preservação do cérebro ressecado para análise posterior. Considerando que a apresentação anterior foi feita específicas para a investigação tumor no cérebro, os conceitos são certamente generalizáveis ​​a outros cânceres humanos que são passíveis de modelagem ortotópico em roedores.

<table border="1">
	<thead>
		<tr>
			<th>Material Name</th>
			<th>Type</th>
			<th>Company</th>
			<th>Catalogue Number</th>
			<th>Comment</th>
		</tr>
	</thead>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Disposable Scapels</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Feather</td>
			<td>2975</td>
			<td>No.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Dunlap</td>
			<td>HP950</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22028563</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Swabs</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Chlorhexidine</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9756995</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Hydrogen Peroxide</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H312P-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25g Needle</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ul Hamilton Sharp Microsyringe</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>20734</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin Stapler and Staples</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>59020</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic Frame</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Stoeling</td>
			<td>51725</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image Software</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Caliper Life Science</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td>Potassium Salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenogen Lumina</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Caliper Life Science</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging

Modelos de transplante usando células tumorais do cérebro humano têm servido uma função essencial em neuro-oncologia pesquisas por muitos anos. No passado, o procedimento mais comumente utilizado para o estabelecimento xenoenxerto humana tumor consistiu na coleta de células de frascos de cultura, seguida pela injeção subcutânea das células coletadas em camundongos imunocomprometidos. Considerando que esta abordagem ainda vê o uso freqüente em muitos laboratórios, tem havido uma mudança significativa de ênfase na última década para a criação xenoenxerto ortotópico, que, no caso de tumores cerebrais, requer a injeção de células tumorais em estruturas apropriadas neuroanatômicas. Porque estabelecimento xenoenxerto intracraniana elimina a capacidade de monitorar o crescimento do tumor através de medição direta, como por uso de pinças, a mudança de ênfase para ortotópico cérebro modelos xenoenxerto tumor exigiu a utilização de não-invasivos de imagem para avaliar a carga tumoral em animais hospedeiros. Dos métodos de imagem disponíveis atualmente, o monitoramento bioluminescência é geralmente considerada a oferecer a melhor combinação de sensibilidade, conveniência e custo. Aqui, iremos demonstrar os procedimentos para o estabelecimento ortotópico de tumor cerebral, e para monitorar o crescimento do tumor ea resposta ao tratamento ao testar terapias experimentais.

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Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging

Luciferase modificados xenotransplantes tumorais humanos cerebral intracraniana pode ser estabelecida em camundongos atímicos, com posterior acompanhamento do crescimento tumoral e resposta à terapia com imagem de bioluminescência. Em combinação com a análise de sobrevivência, o monitoramento bioluminescência é uma ferramenta de pesquisa essencial para ensaios pré-clínicos de terapias sendo considerado para o tratamento de tumores cerebrais.

Estabelecer xenoenxertos tumor intracraniano Cérebro com posterior análise do crescimento tumoral e resposta à terapia com imagem Bioluminescência

Transplantation models using human brain tumor cells have served an essential function in neuro-oncology research for many years. In the past, the most ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

39.0K visualizações.  University of California, San Francisco - UCSF. Luciferase modificados xenotransplantes tumorais humanos cerebral intracraniana pode ser estabelecida em camundongos atímicos, com posterior acompanhamento do crescimento tumoral e resposta à terapia com imagem de bioluminescência. Em combinação com a análise de sobrevivência, o monitoramento bioluminescência é uma ferramenta de pesquisa essencial para ensaios pré-clínicos de terapias sendo considerado para o tratamento de tumores cerebrais.

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Brain Imaging Investigation of the Impairing Effect of Emotion on Cognition

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional distractibility) effects (reviewed in 1). Complementing our recent protocol 2 describing a method that allows investigation of the neural correlates of the memory-enhancing effect of emotion (see also 1, 3-5), here we present a protocol that allows investigation of the neural correlates of the detrimental impact of emotion on cognition. The main feature of this method is that it allows identification of reciprocal modulations between activity in a ventral neural system, involved in 'hot' emotion processing (HotEmo system), and a dorsal system, involved in higher-level 'cold' cognitive/executive processing (ColdEx system), which are linked to cognitive performance and to individual variations in behavior (reviewed in 1). Since its initial introduction 6, this design has proven particularly versatile and influential in the elucidation of various aspects concerning the neural correlates of the detrimental impact of emotional distraction on cognition, with a focus on working memory (WM), and of coping with such distraction 7,11, in both healthy 8-11 and clinical participants 12-14.

We present a protocol that allows investigation of the neural mechanisms mediating the detrimental impact of emotion on cognition, using functional magnetic resonance imaging. This protocol can be used with both healthy and clinical participants.

Investigação por imagem do cérebro o efeito prejudicial da emoção sobre a Cognição

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional ...

Neurociência

Enabling High Grayscale Resolution Displays and Accurate Response Time Measurements on Conventional Computers

Display systems based on conventional computer graphics cards are capable of generating images with 8-bit gray level resolution. However, most experiments in vision research require displays with more than 12 bits of luminance resolution. Several solutions are available. Bit++ 1 and DataPixx 2 use the Digital Visual Interface (DVI) output from graphics cards and high resolution (14 or 16-bit) digital-to-analog converters to drive analog display devices. The VideoSwitcher 3 described here combines analog video signals from the red and blue channels of graphics cards with different weights using a passive resister network 4 and an active circuit to deliver identical video signals to the three channels of color monitors. The method provides an inexpensive way to enable high-resolution monochromatic displays using conventional graphics cards and analog monitors. It can also provide trigger signals that can be used to mark stimulus onsets, making it easy to synchronize visual displays with physiological recordings or response time measurements.
Although computer keyboards and mice are frequently used in measuring response times (RT), the accuracy of these measurements is quite low. The RTbox is a specialized hardware and software solution for accurate RT measurements. Connected to the host computer through a USB connection, the driver of the RTbox is compatible with all conventional operating systems. It uses a microprocessor and high-resolution clock to record the identities and timing of button events, which are buffered until the host computer retrieves them. The recorded button events are not affected by potential timing uncertainties or biases associated with data transmission and processing in the host computer. The asynchronous storage greatly simplifies the design of user programs. Several methods are available to synchronize the clocks of the RTbox and the host computer. The RTbox can also receive external triggers and be used to measure RT with respect to external events. 
Both VideoSwitcher and RTbox are available for users to purchase. The relevant information and many demonstration programs can be found at <a href="http://lobes.usc.edu/">http://lobes.usc.edu/</a>.

Conventional computer hardware can not generate visual stimuli with sufficiently high grayscale resolution and measure response times with sufficient accuracy. We describe how to use the VideoSwitcher to produce high-resolution monochromatic displays, and the RTbox to measure response times with high accuracy on conventional computer hardware.

Ativando alta escala de cinza monitores de resolução e Medidas resposta precisa de tempo em computadores convencionais

Display systems based on conventional computer graphics cards are capable of generating images with 8-bit gray level resolution. However, most experiments ...

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in glioblastoma mutliforme (GBM), is to identify and isolate tumor initiating cell population(s) to investigate their role in tumor formation, progression, and recurrence. Understanding tumor initiating cell populations will provide clues to finding effective therapeutic approaches for these tumors. The neurosphere assay (NSA) due to its simplicity and reproducibility has been used as the method of choice for isolation and propagation of many of this tumor cells. This protocol demonstrates the neurosphere culture method to isolate and expand stem-like cells in surgically resected human GBM tumor tissue. The procedures include an initial chemical digestion and mechanical dissociation of tumor tissue, and subsequently plating the resulting single cell suspension in NSA culture. After 7-10 days, primary neurospheres of 150-200 &mu;m in diameter can be observed and are ready for further passaging and expansion.

This video protocol demonstrates the isolation and expansion of stem like cells from surgically resected human glioblastoma mutliforme (GBM) tumor tissue using the neurosphere assay culture method.

Isolamento e Expansão da Human Glioblastoma Multiforme Células Tumorais Utilizando o Ensaio Neurosphere

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

Co-analysis of Brain Structure and Function using fMRI and Diffusion-weighted Imaging

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when studying the brain, as the functional role that a brain area fulfills may be largely defined by its connections to other brain areas. In this report, we describe a novel, non-invasive approach for relating brain structure and function using magnetic resonance imaging (MRI). This approach, a combination of structural imaging of long-range fiber connections and functional imaging data, is illustrated in two distinct cognitive domains, visual attention and face perception. Structural imaging is performed with diffusion-weighted imaging (DWI) and fiber tractography, which track the diffusion of water molecules along white-matter fiber tracts in the brain (Figure 1). By visualizing these fiber tracts, we are able to investigate the long-range connective architecture of the brain. The results compare favorably with one of the most widely-used techniques in DWI, diffusion tensor imaging (DTI). DTI is unable to resolve complex configurations of fiber tracts, limiting its utility for constructing detailed, anatomically-informed models of brain function. In contrast, our analyses reproduce known neuroanatomy with precision and accuracy. This advantage is partly due to data acquisition procedures: while many DTI protocols measure diffusion in a small number of directions (e.g., 6 or 12), we employ a diffusion spectrum imaging (DSI)1, 2 protocol which assesses diffusion in 257 directions and at a range of magnetic gradient strengths. Moreover, DSI data allow us to use more sophisticated methods for reconstructing acquired data. In two experiments (visual attention and face perception), tractography reveals that co-active areas of the human brain are anatomically connected, supporting extant hypotheses that they form functional networks. DWI allows us to create a "circuit diagram" and reproduce it on an individual-subject basis, for the purpose of monitoring task-relevant brain activity in networks of interest.

We describe a novel approach for simultaneous analysis of brain function and structure using magnetic resonance imaging (MRI). We assess brain structure with high-resolution diffusion-weighted imaging and white-matter fiber tractography. Unlike standard structural MRI, these techniques allow us to directly relate anatomical connectivity to functional properties of brain networks.

Co-análise de estrutura e função cerebral usando ressonância magnética funcional e imagem ponderada em difusão

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis and enable new strategies for in vitro modeling or repairing the diseased brain. Identifying brain-resident non-neuronal cell types amenable to direct conversion into iNs might allow for launching such an approach in situ, i.e. within the damaged brain tissue. Here we describe a protocol developed in the attempt of identifying cells derived from the adult human brain that fulfill this premise. This protocol involves: (1) the culturing of human cells from the cerebral cortex obtained from adult human brain biopsies; (2) the in vitro expansion (approximately requiring 2-4 weeks) and characterization of the culture by immunocytochemistry and flow cytometry; (3) the enrichment by fluorescence-activated cell sorting (FACS) using anti-PDGF receptor-&#946; and anti-CD146 antibodies; (4) the retrovirus-mediated transduction with the neurogenic transcription factors sox2 and ascl1; (5) and finally the characterization of the resultant pericyte-derived induced neurons (PdiNs) by immunocytochemistry (14 days to 8 weeks following retroviral transduction). At this stage, iNs can be probed for their electrical properties by patch-clamp recording. This protocol provides a highly reproducible procedure for the in vitro lineage conversion of brain-resident pericytes into functional human iNs.

Targeting brain-resident cells for direct lineage-reprogramming offers new perspectives for brain repair. Here we describe a protocol of how to prepare cultures enriched for brain-resident pericytes from the adult human cerebral cortex and convert these into induced neurons by retrovirus-mediated expression of the transcription factors Sox2 and Ascl1.

Lineage-reprogramação de células pericyte derivados do Adulto Cérebro Humano em neurônios induzidos

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible are badly known. Excitotoxicity, a process believed to contribute to neuron damage induced by both insults, is mediated by activation of glutamate receptors that promotes Ca2+ influx and mitochondrial Ca2+ overload. A substantial change in intracellular Ca2+ homeostasis or remodeling of intracellular Ca2+ homeostasis may favor neuron damage in old neurons. For investigating Ca2+ remodeling in aging we have used live cell imaging in long-term cultures of rat hippocampal neurons that resemble in some aspects aged neurons in vivo. For this end, hippocampal cells are, in first place, freshly dispersed from new born rat hippocampi and plated on poli-D-lysine coated, glass coverslips. Then cultures are kept in controlled media for several days or several weeks for investigating young and old neurons, respectively. Second, cultured neurons are loaded with fura2 and subjected to measurements of cytosolic Ca2+ concentration using digital fluorescence ratio imaging. Third, cultured neurons are transfected with plasmids expressing a tandem of low-affinity aequorin and GFP targeted to mitochondria. After 24 hr, aequorin inside cells is reconstituted with coelenterazine and neurons are subjected to bioluminescence imaging for monitoring of mitochondrial Ca2+ concentration. This three-step procedure allows the monitoring of cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to relevant stimuli as for example the glutamate receptor agonist NMDA and compare whether these and other responses are influenced by aging. This procedure may yield new insights as to how aging influence cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to selected stimuli as well as the testing of selected drugs aimed at preventing neuron cell death in age-related diseases.

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

Fluorescência e imagem de bioluminescência subcelular Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Aged em neurônios do hipocampo

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

Preparação de fatias de cérebro aguda usando um otimizado N-metil-D-método de proteção de recuperação glucamine

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, formed by ribosomes, mRNAs, several proteins and non-coding RNAs, represent integrated platforms where translational controls take place. However, while the ribosome has been widely studied, the organization of polysomes is still lacking comprehensive understanding. Thus much effort is required in order to elucidate polysome organization and any novel mechanism of translational control that may be embedded. Atomic force microscopy (AFM) is a type of scanning probe microscopy that allows the acquisition of 3D images at nanoscale resolution. Compared to electron microscopy (EM) techniques, one of the main advantages of AFM is that it can acquire thousands of images both in air and in solution, enabling the sample to be maintained under near physiological conditions without any need for staining and fixing procedures. Here, a detailed protocol for the accurate purification of polysomes from mouse brain and their deposition on mica substrates is described. This protocol enables polysome imaging in air and liquid with AFM and their reconstruction as three-dimensional objects. Complementary to cryo-electron microscopy (cryo-EM), the proposed method can be conveniently used for systematically analyzing polysomes and studying their organization.

While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.

Olhando para Cérebro polissomos com Microscopia de Força Atômica

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Kinematic Analysis Using 3D Motion Capture of Drinking Task in People With and Without Upper-extremity Impairments

Kinematic analysis is a powerful method for objective assessment of upper extremity movements in a three-dimensional (3D) space. Three-dimensional motion capture with an optoelectronic camera system is considered as golden standard for kinematic movement analysis and is increasingly used as outcome measure to evaluate the movement performance and quality after an injury or disease involving upper extremity movements. This article describes a standardized protocol for kinematic analysis of drinking task applied in individuals with upper extremity impairments after stroke. The drinking task incorporates reaching, grasping and lifting a cup from a table to take a drink, placing the cup back, and moving the hand back to the edge of the table. The sitting position is standardized to the individual&#39;s body size and the task is performed in a comfortable self-paced speed and compensatory movements are not constrained. The intention is to keep the task natural and close to a real-life situation to improve the ecological validity of the protocol. A 5-camera motion capture system is used to gather 3D coordinate positions from 9 retroreflective markers positioned on anatomical landmarks of the arm, trunk, and face. A simple single marker placement is used to ensure the feasibility of the protocol in clinical settings. Custom-made Matlab software provides automated and fast analyses of movement data. Temporal kinematics of movement time, velocity, peak velocity, time of peak velocity, and smoothness (number of movement units) along with spatial angular kinematics of shoulder and elbow joint as well as trunk movements are calculated. The drinking task is a valid assessment for individuals with moderate and mild upper extremity impairment. The construct, discriminative and concurrent validity along with responsiveness (sensitivity to change) of the kinematic variables obtained from the drinking task have been established.

This protocol describes an objective method to evaluate the movement performance and sensorimotor function of the upper extremity applied to individuals with stroke and healthy controls. A standardized test procedure, kinematic analysis and outcome variables for three-dimensional motion capture of drinking task are provided.

Análise cinemática usando 3D Motion Capture da tarefa bebendo em pessoas com e sem deficiências extremidade superior

Kinematic analysis is a powerful method for objective assessment of upper extremity movements in a three-dimensional (3D) space. Three-dimensional motion ...

Analyzing Neural Activity and Connectivity Using Intracranial EEG Data with SPM Software

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive neuroscience. Intracranial electroencephalography (EEG) can directly record electrical neural activity and has the unique potential to accomplish this goal. Traditionally, averaging analysis has been applied to analyze intracranial EEG data; however, several new techniques are available for depicting neural activity and intra- and inter-regional connectivity. Here, we introduce two analytical protocols we recently applied to analyze intracranial EEG data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency SPM analysis for neural activity and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity. We report our analysis of intracranial EEG data during the observation of faces as representative results. The results revealed that the inferior occipital gyrus (IOG) showed gamma-band activity at very early stages (110 ms) in response to faces, and both the IOG and amygdala showed rapid intra- and inter-regional connectivity using various types of oscillations. These analytical protocols have the potential to identify the neural mechanisms underlying cognitive functions with high spatial and temporal profiles.

We present two analytical protocols that can be used to analyze intracranial electroencephalography data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency statistical parametric mapping analysis for neural activity, and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity.

Analisando a atividade Neural e conectividade usando dados de EEG intracraniano com SPM Software

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive ...