Dr. Keating é financiado pelo CA100335 concessão DOD e é um St. Baldrick Foundation Scholar.

Todos os procedimentos foram revistos e aprovados por nosso comitê de cuidados com os animais e uso institucional. 1 Plano do Experimento <ol><li> Escolha células a serem injectadas. As células a partir de uma variedade de fontes, são candidatos para injecção: as linhas de cultura de células aderentes, clones geneticamente modificados, culturas de células primárias, Neurosphere ou tumores desagregados. O tipo de modelo desejado irá definir o local mais apropriado da injecção. <ol><li> Determinar o número de células de injeção. O número de células é necessária para formar os tumores varia com a linha de células e têm de ser determinadas empiricamente; taxa de crescimento do tumor depende fortemente do tipo de célula, e o número de células de cultura de tecidos número passagem. Os números de células que variam de 1 x outubro 4-2 x 10 5 ou mais por injecção produziram tumores de diferentes taxas de crescimento. </li><li> Limitar o volume de injeção. As células devem ser suspensos no menor volume de meios de comunicação livres de soro ou de fosfato sAline (PBS) que permite liso, a passagem fácil através de uma agulha G 26. Quanto menor o volume efectivamente fornecido para o cérebro, o mais preciso e definido o tumor resultante; os melhores resultados são obtidos através da injecção de volumes que variam de 3 a 6 ul. Plano para preparar um volume total final de, pelo menos, 50 ul de suspensão de células, independentemente do número de injecções planeados, para permitir uma medição precisa, misturando e amostragem. </li></ol></li><li> Escolha camundongos apropriado para o modelo. Modelos murinos de tumores humanos utilizam tipicamente jovens ratinhos imuno-comprometidos, para evitar a rejeição do enxerto mediada imune. Não é necessário para o trabalho a realizar-se em uma cabine de segurança biológica, se tomem as devidas precauções, incluindo a descontaminação, desinfecção e esterilização de materiais e equipamentos. O trabalho mostrado aqui foi feito em ratos nus atímicos, do sexo masculino e do sexo feminino, entre 6 e 12 semanas de idade. Os ratinhos que pesam menos de 20 g pode ser difícil posicionar sobre comoquadro tereotaxic e podem ser mais suscetíveis à hipotermia. </li></ol> 2 Monte o Equipamento <ol><li> Obtenha e descontaminar um rato quadro estereotáxico, console de alinhamento e suporte de cabeça anestesia gás rato, bomba de micro, almofada de calor, aparelho de anestesia, fibra óptica lâmpada de trabalho, e broca rotativa de velocidade variável. Limpar e descontaminar todos os equipamentos. </li><li> Programar os parâmetros de injecção (incluindo volume de injecção, a taxa de, unidades de razão, o tipo de seringa de fluxo) e outras variáveis ​​necessários para o funcionamento da bomba de seringa. Otimizar as configurações para cada modelo específico. Observação: nessas injeções as configurações foram 3.000 amostras nl a uma taxa de 400 nl / min (unidades de taxa &quot;M&quot;) usando uma seringa de 25 mL (tipo de dispositivo &quot;E&quot;) no modo não agrupada (&quot;N&quot;). </li><li> Limpar uma micro de precisão com 26 L de agulha com várias lavagens de água estéril de s ionizada (DIH 2 O) e 70% de etanol (EtOH), fazendo um ri definitivanse com Dih 2 O. Alguns, mas não todos os modelos são projetados para ser autoclavados. Certifique-se de que o movimento do pistão é suave e livre. </li><li> Obter equipamentos de anestesia. Isoflurano é o anestésico preferido, uma vez que é fácil de regular a profundidade e duração da anestesia. Certifique-se de que a unidade estereotáxica é equipado com um acessório de gás anestesia rato e que a tubulação e conectores necessários estão no local para entregar a mistura de gases do aparelho de anestesia com o mouse. </li><li> Instrumentos cirúrgicos autoclave, incluindo uma tesoura de ponta fina, duas pinças / hemostatos (com dentes) para sutura, tesouras, pinças e médio porte médio e de ponta fina, e pelo menos dois 1 milímetro brocas dentárias. Manter instrumentos limpos durante o procedimento com 70% de EtOH, desinfectante, ou um esterilizador talão. </li><li> Obter isoflurano, analgésico, pomada oftálmica / lubrificante, pomada antibiótica, salino, 30% de peróxido de hidrogénio (H 2 O 2), anti-séptico, e cera de osso (se desejado) a partir de umfornecimento veterinária ou médica. Prepare estéril dih 2 O e 70% de EtOH. Materiais descartáveis, tais como gaze, curativos estéreis, suturas, cotonetes etanol, algodão derrubado cotonetes, luvas cirúrgicas estéreis, lâminas cirúrgicas e mais estão especificados na lista de materiais. Um marcador permanente ponta fina para a marcação do crânio devem ser descontaminados e dedicada para uso cirúrgico. </li></ol> 3 Prepare Células para Injeção <ol><li> Nos experimentos mostrados aqui, selecione uma linhagem humana imortalizada celular GBM. Determinar o número de células (2 x 10 5) e o volume de suspensão para ser injectada (3 ul) empiricamente; Detalhes podem variar com o tipo de célula. Use um volume de pelo menos 50 ul para facilitar a exata medição, mistura e injeção. </li><li> Trypsinize células e ressuspender em mídia ou PBS. Execute as seguintes etapas imediatamente antes da injeção de células: <ol><li> Remova a mídia de células por aspiração e lavar com 10 ml PBS por placa de 100 mm; remover PBS. </li><li> Anúnciod 1 ml de tripsina a cada placa de 100 mm e incubar à temperatura ambiente o tempo suficiente para se obter uma suspensão de célula única. </li><li> Pare a actividade da tripsina com 5 ml de Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) + 10% de soro fetal bovino (FBS) por placa de 100 mm. </li><li> Células por centrifugação a 450 xg e ressuspender em ~ 5 ml de soro DMEM livre (SF-DMEM) por placa de 100 mm. </li><li> Contagem de células viáveis ​​utilizando um hemacitómetro, ou um contador de células automatizado. </li><li> Ajustar a densidade de células vivas para 2 x 10 5 células / 3 mL (ou conforme determinado por experimentação) por sedimentação das células e ressuspender em SF-DMEM. </li></ol></li><li> Mantenha células refrigerados com gelo ou um pacote de frio (não permitir que as células de congelar). Misture delicadamente por estalar os dedos. </li></ol> 4. Anestesie e Prepare mouse para Cirurgia <ol><li> Induzir a anestesia utilizando ~ 5% de isoflurano (fluxo de oxigênio ~ 2 L / min) ou conforme indicado pelo veterinário. Indução deve levar 2-3 min. Manter o mouse em uma profundidade adequadade anestesia com ~ 3% de isoflurano. <ol><li> Verifique a profundidade de anestesia por aperto do dedo do pé, ajustar isoflurano se indicado e continuar a monitorizar a respiração e toe resposta aperto ao longo do procedimento. Cubra rato com compressas de gaze para o calor e monitorar rato regularmente durante todo o procedimento, que pode demorar de 45 minutos a 1 hora, dependendo da taxa de injeção. </li></ol></li><li> Posicione o mouse no quadro estereotáxico cuidadosamente deslizando a barra paladar sobre a língua e na boca. Gancho incisivos da frente para o buraco do dente. Use barras de ouvido para estabilizar a cabeça, com a superfície da orelha-de-olho mais próximo da horizontal possível. Não force bares no canal do ouvido. É fundamental para posicionar a cabeça de forma segura: confira o movimento lado-a-lado e para cima e para baixo suavemente com os dedos. Use os controles ajustáveis ​​da unidade estereotáxico para otimizar o ajuste. </li><li> Lubrifique os olhos com pomada oftálmica. Limpe a pele entre as orelhas e os olhos duas vezes com a alternância de aplicações de um povidone-iodine anti-séptico e de 70% de EtOH. </li><li> Injetar por via subcutânea analgésico escolhido (SQ) no flanco (ou conforme indicado). </li></ol> 5. Execute Injeção <ol><li> Determine o local da injeção. O local de injecção pode variar com o tamanho e estirpe de rato e do tipo de célula. Células injectadas muito perto dos ventrículos pode levar a crânio-espinal propagação da doença. As células injetadas muito raso pode crescer para fora através da pista agulha. Nota: Nas experiências apresentadas aqui, o alvo foi definida como a região frontal do córtex cerebral de uma área de 2,5 mm lateral (direita), 1,5 mm anterior e 3,5 mm ventral em relação ao bregma foi escolhido (Figura 1), produzindo um tumor do cérebro médio em ratos variando de 20 a 30 g. </li><li> Fazer uma pequena incisão (~ 8 mm de comprimento) utilizando uma técnica estéril, através da pele da cabeça para expor o bregma e o local da injecção. Um corte em bisel, a partir de um ponto situado entre o eixo da linha média e o olho direito no sentido da orelha direita ( <strong&gt; Figura 2) permite o acesso a ambos o bregma e o local da injecção. </li><li> Retrair a pele e usar uma mecha de algodão estéril para secar a superfície do crânio. Seque o osso com uma outra compressa humedecida com H 2 O 2 para visualizar bregma. O H 2 O 2 irá produzir bolhas de oxigênio, deixando linhas finas de espuma branca ao longo das suturas coronal e sagital que se cruzam em bregma. </li><li> Bloquear uma seringa vazia com agulha para a microbomba e manobrar a ponta da agulha directamente sobre a bregma; conjunto de coordenadas no console alinhamento a 0,0 mm lateral, 0,0 milímetros anterior / posterior, e 0,0 milímetros ventral / dorsal. </li><li> Mova a agulha 2,5 mm lateral (direita) e 1,5 mm anterior em relação ao bregma (ou local desejado) usando os botões de controle na unidade estereotáxico. Levante a seringa ligeiramente e marcar a localização exacta sobre o crânio com uma caneta com ponta de feltro dedicado. Se a superfície externa do crânio que não é num plano horizontal com bregma (i.e., o dorsal / ventral coordenar já não lê zero), redefinir o ventral / dorsal lendo a 0,0 para garantir que a profundidade da injeção não é deslocada. </li><li> Faça um furo pequeno no crânio com uma broca rotativa de mão equipado com uma ponta dental estéril no local apropriado marcado com a caneta na etapa 5.5. Segurar a broca em um ângulo para o crânio e toque muito suave da ponta para o osso. Repita conforme necessário. A perfuração quase, mas não completamente através do osso, deixando a agulha penetrar, na verdade, para esta camada do crânio, resulta na injecção limpa. </li><li> Remova o pó de osso com um cotonete embebido em PBS ou soro fisiológico. Volte a seringa à bomba e abaixe a agulha em linha reta até o orifício de trepanação para confirmar localização. Se o orifício de trepanação não está centrada com a agulha, utilizar a broca para alargar a abertura. </li><li> Misture suavemente a suspensão de células e extrair as células para dentro da seringa utilizando o controlador da bomba. Evite bolhas e pedaços e limpe a sagacidade agulhah um algodão embebido em álcool para remover células contaminantes na superfície exterior. Se a seringa / agulha está entupido ou congelado, retire e rapidamente limpar com água estéril e etanol 70%. </li><li> Diminuir a agulha para o nível da superfície do crânio (0,0 milímetros ventral / dorsal). Em seguida, lentamente (ao longo de aproximadamente 1 min) inferior a agulha para perfurar a espessura total do crânio e penetrar no cérebro para uma profundidade de 4 mm ventrall. Retire a agulha lentamente a 3,5 mm ventral. Se a cabeça do rato é realizada de forma segura no aparelho estereotáxico, deve haver quase nenhum movimento do crânio. </li><li> Confirme se os parâmetros corretos são inseridos no controlador da bomba (Seção 2.2) e pressione &quot;RUN / STOP&quot; (ou como indicado pelo manual do produto) para autoinject células. Monitorar o mouse e ajustar o isoflurano, se indicado. Assista a seringa e garantir que o êmbolo se move no barril. Movimento congelado ou entupido pode resultar em uma inclinação / atuador quebrado. </li><li> Esperar 1 a 2 minutos, com a agulha na bchuva, em seguida, muito lentamente (mais de 3-4 min) retirar agulha do tecido. O tempo total para remover a agulha após a injecção está completa é de 5 min. Utilize um cotonete para apagar a área ao redor do orifício de trepanação; deixar os bordos da pele aberta para permitir que o osso para secar. </li><li> Remover a bomba de seringa e rapidamente lavar 3x com H 2 O estéril, 3 x com 70% de EtOH, e 3x com H 2 O estéril (ou como indicado pelo fabricante). Limpe a agulha com EtOH e reserve. </li><li> Aplicar cera óssea estéril (equivalente a 1 ou 2 ul) para o orifício de trepanação e utilizar a fim de madeira de uma mecha de algodão estéril para conter a cera sobre e dentro do osso. Se a superfície é seca de forma adequada, ele deve manter. </li><li> Espalhe campo estéril sobre a área de trabalho com o mouse e entorno e suturar a incisão; três pontos devem ser suficientes. Alternativamente, o adesivo cirúrgico pode ser usado. Aplicar um antibiótico tópico. </li><li> Reduzir isoflurano para 0% e remover o mouse da unidade estereotáxica, sendo careful para proteger os dentes. Verifique ouvidos, boca e língua. </li><li> Monitorar o mouse seguindo de perto a injeção. Colocar o mouse sobre uma almofada de calor por 5 a 10 minutos; em seguida, transferir a gaiola (na almofada de calor) e observar até rato acorda e é ambulatorial. Não deixe o mouse autônoma até que ele recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Não devolva o mouse para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado. Considere o uso de analgésicos adicionais se os sinais de dor são notados. </li></ol> 6. Finish e Recuperação Monitor &amp; Desenvolvimento Tumor <ol><li> Limpe todos os instrumentos e equipamentos que utilizam etanol 70%, um esterilizador talão ou desinfetante entre ratos. </li><li> Monitorizar os ratinhos injectados durante dois dias após o procedimento de sinais de dor, infecção ou outras complicações. Injetar analgésicos em 24 e 48 horas (ou conforme indicado) após o procedimento. Remover suturas em 7 a 10 dias, se necessário. </li><li> Avaliar os ratos para sinais clínicos da doença, paralysis, diminuição da atividade, perda de peso, convulsões ou doenças em geral. </li><li> Acompanhar o desenvolvimento do tumor através dos meios apropriados [ressonância magnética (MRI), In Vivo Imaging Systems (IVIS), etc]. </li></ol>

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	<li>Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-germline+genetically+engineered+mouse+models+for+translational+cancer+research.">Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research.</a> Nature reviews. Cancer. 10, 470-480 (2010).</li><li>Yamada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+accurately+inject+tumor+cells+into+the+caudate/putamen+nuclei+of+the+mouse+brain.">A method to accurately inject tumor cells into the caudate/putamen nuclei of the mouse brain.</a> The Tokai journal of experimental and clinical medicine. 29, 167-173 (2004).</li><li>Brooks, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+and+efficient+murine+CNS+gene+delivery+using+a+microprocessor-controlled+injector.">Reproducible and efficient murine CNS gene delivery using a microprocessor-controlled injector.</a> Journal of neuroscience. 80, 137-147 (1998).</li><li>Shankavaram, U. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+indicates+orthotopic+xenograft+of+glioma+cell+lines+simulate+a+subclass+of+human+glioblastoma.">Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma.</a> Journal of cellular and molecular medicine. 16, 545-554 (2012).</li><li>Giannini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+tumor+EGFR+and+PDGFRA+gene+amplifications+retained+in+an+invasive+intracranial+xenograft+model+of+glioblastoma+multiforme.">Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme.</a> Neuro-oncology. 7, 164-176 (2005).</li><li>Yi, D., Hua, T. X., Lin, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+gene+overexpression+retained+in+an+invasive+xenograft+model+by+solid+orthotopic+transplantation+of+human+glioblastoma+multiforme+into+nude+mice.">EGFR gene overexpression retained in an invasive xenograft model by solid orthotopic transplantation of human glioblastoma multiforme into nude mice.</a> Cancer investigation. 29, 229-239 (2011).</li><li>Carty, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+injection+of+AAV+expressing+NEP+but+not+IDE+reduces+amyloid+pathology+in+APP+PS1+transgenic+mice.">Intracranial injection of AAV expressing NEP but not IDE reduces amyloid pathology in APP+PS1 transgenic mice.</a> PLos ONE. 8, e59626 (2013).</li><li>Thaci, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetic+study+of+neural+stem+cell-based+cell+carrier+for+oncolytic+virotherapy:+targeted+delivery+of+the+therapeutic+payload+in+an+orthotopic+brain+tumor+model.">Pharmacokinetic study of neural stem cell-based cell carrier for oncolytic virotherapy: targeted delivery of the therapeutic payload in an orthotopic brain tumor model.</a> Cancer gene therapy. 19, 431-442 (2012).</li><li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+intracranial+brain+tumor+xenografts+with+subsequent+analysis+of+tumor+growth+and+response+to+therapy+using+bioluminescence+imaging.">Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging.</a> J. Vis. Exp. (41), (2010).</li><li>Valadez, J. G., Sarangi, A., Lundberg, C. J., Cooper, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+orthotopic+glioma+xenografts+recapitulate+infiltrative+growth+and+isocitrate+dehydrogenase+I+mutation.">Primary orthotopic glioma xenografts recapitulate infiltrative growth and isocitrate dehydrogenase I mutation.</a> J. Vis. Exp. (83), (2014).</li><li>Baumann, B. C., Dorsey, J. F., Benci, J. L., Joh, D. Y., Kao, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotactic+intracranial+implantation+and+in+vivo+bioluminescent+imaging+of+tumor+xenografts+in+a+mouse+model+system+of+glioblastoma+multiforme.">Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme.</a> J. Vis. Exp. (67), (2012).</li><li>Iwami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+of+intracranial+injection+via+the+postglenoid+foramen+for+brain+tumor+mouse+models.">A novel method of intracranial injection via the postglenoid foramen for brain tumor mouse models.</a> Journal of neurosurgery. 116, 630-635 (2012).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Modelos de mouse ortotópico de câncer de cérebro humano pode ser uma excelente ferramenta para avaliar a eficácia das terapias clínicas, mas é preciso ter cuidado para otimizar a colocação de células no tecido cerebral. Estudos têm demonstrado que os volumes de alíquotas excessivas, técnica de injeção abaixo do ideal e taxas de injecção precipitadas podem levar a leakiness eo aparecimento de células tumorais em locais indesejáveis ​​(ventrículos, medula espinhal, regiões extradurais, etc.)</e...

Estudos in vitro de células tumorais do cérebro são de valor inestimável para dissecar mecanismos moleculares crescimento, sobrevivência, migração e invasão das células cancerosas de condução; experiências em células cultivadas pode definir as vias de sinalização, sugerem potenciais alvos terapêuticos, e caracterizar a resposta celular ao tratamento com droga. Mas in vitro sistemas são demasiado simplista para prever a resposta do organismo aos medicamentos; faltam as reacções fisiológicas, as respostas imunes, microambiente celular, e heterogeneidade global dos sistemas de animais vivos. Geneticamente modificados modelos pode ser inestimável, quando disponível, mas existem diferenças moleculares entre as espécies e células de ratinho não pode recapitular eventos em processos humanos, resultando em diferenças significativas quando se comparam modelos animais para observações clínicas 1. Modelos de xenotransplante de rato envolvendo subcutânea (SQ) de injecção de linhas de células de tumor cerebral humanas sob a pele do flanco são fáceis de realizare medir; eles podem ser utilizados para tratar os efeitos de modificação do gene e a administração do fármaco / distribuição, o metabolismo e a toxicidade. Desvantagens significativas, no entanto, limitar a utilidade de modelos SQ. O microambiente não recapitular o de um tumor cerebral que ocorre naturalmente: as interacções de vários tipos de células e tecidos; vasculatura local, e uma miríade de outros factores única para o cérebro não pode ser replicado. Para reproduzir de forma mais precisa o único meio de um tumor cerebral que ocorre naturalmente e testar os efeitos da intervenção farmacêutica, deve ser utilizado um modelo ortotópico de rato. Além disso, as técnicas de ortotópicos pode ser utilizado como parte de uma abordagem de engenharia genética em que as células não-cancerosas humanas primárias (diferenciadas ou progenitoras) são geneticamente modificados e injectada no sítio correspondente de um rato, com ou sem as células do estroma humanas, resultando em tumorigénese semelhante ao observado em seres humanos um. Este artigo descreveuma metodologia para criar com precisão e de forma reprodutível os tumores do cérebro em ratos. Utilizando esta técnica, o utilizador pode injectar com precisão uma pequena alíquota de suspensão de células em uma localização da região fronto-parietal-temporal do córtex cerebral do rato determinado. Mortalidade Mouse é extremamente baixo; em nossas mãos, não os ratos morreram de complicações cirúrgicas após 185 procedimentos. Características do tumor resultante pode ser comparado com o de tumores humanos clínicos típicos; por exemplo: a rapidez de crescimento, o grau de necrose, a extensão da invasão, a heterogeneidade do tipo de células, a presença de células mitóticas, marcadores de proliferação e apoptose, etc As linhas de células ou de tecidos ou amostras de tumores humanos desagregados pode então ser avaliada com base na sua capacidade para simular quadro clínico real. Pharmaceuticals, seleccionadas com base no seu desempenho em cultura de células, podem ser testadas no âmbito de um metabolismo de funcionamento, sistema circulatório, e barreira sangue-cérebro, como elas existem em um animal sobrecarregados witha do tumor, todos em um contexto de arquitectura relevantes. Além disso, as células escolhidas para injecção pode ser geneticamente modificado para investigar o impacto de knockdowns específicos, deleções, knock-ins, mutações, etc, sobre o crescimento de tumores e sobrevivência. Um número de publicações documentam tumores estudos usando uma variedade de técnicas intracranianas. Yamada et al. Fez um estudo detalhado da injeção de corante e de células U87 e descobriu que a minimização do volume e injeção taxa produziu o melhor tumor 2. . Brooks et al encontraram reprodutibilidade superior e eficiência usando um injector controlado por um microprocessador, em vez de um método manual para entregar os vectores virais; suas conclusões sobre os parâmetros de injeção ideais são aplicáveis ​​a entrega de 3 células. Shankavaram et al. Mostrou que o glioblastoma multiforme (GBM) linhas de células injectadas ortotopicamente (utilizando um método manual) no cérebro recapitulado no perfil da expressão do gene cltumores inical mais perto do que in vitro ou SQ xenotransplantes, apoiando o uso de modelos intracranianos para estudos pré-clínicos 4. Giannini et al. Células de espécimes cirúrgicos humanos que haviam sido sustentados nos flancos de ratos nu por passagens em série no cérebro de camundongos injetados adicionais, e mostrou que esta abordagem preservada alterações genéticas do tumor do paciente no modelo 5. Resultados semelhantes foram relatados por Yi et al 6. Usando uma configuração estereotáxica, local da injeção cuidadosamente definidos, e uma taxa de injeção lenta e constante, obtiveram tumores cerebrais reprodutíveis com taxas de crescimento consistentes e alta (100%) Taxa de enxerto. A validade desta técnica, portanto, foi bem estabelecida; uma pesquisa bibliográfica sugere que as aplicações desta técnica são extensas. Carty et al. Utilizado injecções intracranianos para entregar com sucesso vectores virais que expressam genes terapêuticos para o córtex frontal de transgenic modelo de doença de Alzheimer 7. Thaci et al. Descreveu a utilização de injecções intra-cranianas para entregar adenovírus oncolítico terapêutico num transportador base de células estaminais neuronais em ratinhos nus portadores de tumores GBM já ortotopicamente injectados 8. Claramente, as injeções intracranianas são uma ferramenta versátil e eficaz para a investigação pré-clínica. Publicações anteriores no Jornal of Experiments visualizado descrevem abordagens fundamentais 9-11, mas tomamos o conceito de injeção de tumor intracraniano e modelagem ortotópico a um maior nível de precisão usando a tecnologia fácil de dominar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="866">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:87px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:287px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Equipment</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:349px;">Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console.</td>
			<td style="width:87px;">Kopf</td>
			<td style="width:145px;">Model 940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Mouse Gas Anesthesia Head Holder</td>
			<td style="width:87px;">Kopf</td>
			<td style="width:145px;">Model 923-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Mouse Ear Bars</td>
			<td style="width:87px;">Kopf</td>
			<td style="width:145px;">Medel 922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Fiber Optic Illuminator</td>
			<td style="width:87px;">Fisher</td>
			<td style="width:145px;">12-562-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">UltraMicroPump III</td>
			<td style="width:87px;">WPI</td>
			<td style="width:145px;">UMP3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Micro4 microprocessor</td>
			<td style="width:87px;">WPI</td>
			<td style="width:145px;">UMC4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Variable speed hand-held rotary drill</td>
			<td style="width:87px;">Dremel</td>
			<td style="width:145px;">Model 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Dental drill bit, 1.0 mm</td>
			<td style="width:87px;">Spoelting</td>
			<td style="width:145px;">514554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Adaptor for dental drill bit: 3/32 inch collet</td>
			<td style="width:87px;">Dremel</td>
			<td style="width:145px;">481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Heating pad</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td>for mice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Isoflurane vaporizer system</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td>for mice</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:349px;">Medical tubing and connectors</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:287px;">to connect isoflurane vaporizer with stereotaxic frame</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Instruments</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Precision 25 ul micro syringe</td>
			<td style="width:87px;">Hamilton&#160;</td>
			<td style="width:145px;">7636-01</td>
			<td>Model 702, without needle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Microsyringe needles, 26s gauge&#160;</td>
			<td style="width:87px;">Hamilton&#160;</td>
			<td style="width:145px;">7804-04</td>
			<td>RN, 25 mm point style 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Fine-tipped scissors (straight, sharp/sharp)</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Medium-sized standard scissors</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Standard serrated forceps</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Serrated hemostats (2)</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Fine-tipped forceps</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Supplies</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Sutures 5-0 vicryl P-3 13 mm (Ethicon)</td>
			<td style="width:87px;">MWI</td>
			<td style="width:145px;">J463G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Surgical blades #10, stainless (Feather)</td>
			<td style="width:87px;">Fisher</td>
			<td style="width:145px;">296#10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:349px;">Isoflurane (Fluriso)&#160;</td>
			<td style="width:87px;">VetOne&#160;</td>
			<td style="width:145px;">NDC 13985-528-60</td>
			<td style="width:287px;">Item #502017. Liquid inhalation anesthetic. federal law restricts this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Carprofen (Rimadyl Injectable 50 mg/mL)&#160;</td>
			<td style="width:87px;">Pfizer</td>
			<td style="width:145px;">NDC 61106-8507-01</td>
			<td>dilute in saline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Ophthalmic ointment (artificial tears)</td>
			<td style="width:87px;">Rugby</td>
			<td style="width:145px;">NDC 0536-6550-91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Topical antibiotic (AK-Poly-Bac )</td>
			<td style="width:87px;">Akorn</td>
			<td style="width:145px;">NDC 17478-238-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Povidone-iodine topical antiseptic, 10% (Betadine)</td>
			<td style="width:87px;">Betadine</td>
			<td style="width:145px;">NDC 67618-150-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Hydrogen Peroxide, 30%</td>
			<td style="width:87px;">Fisher&#160;</td>
			<td style="width:145px;">H325-100</td>
			<td>for visualizing skull landmarks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Sterile saline</td>
			<td style="width:87px;">VetOne&#160;&#160;</td>
			<td style="width:145px;">NDC 13985-807-25</td>
			<td>for diluting solutions, cleaning tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Bone wax</td>
			<td style="width:87px;">WPI</td>
			<td style="width:145px;">Item #501771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Sterile drapes</td>
			<td style="width:87px;">McKesson</td>
			<td style="width:145px;">25-517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Sterile surgical gloves</td>
			<td style="width:87px;">McKesson</td>
			<td style="width:145px;">(to fit)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Sterile gauze pads, 2 x 2</td>
			<td style="width:87px;">Fisherbrand&#160;</td>
			<td style="width:145px;">22028556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Sterile gauze pads, 4 x 4</td>
			<td style="width:87px;">Fisherbrand&#160;</td>
			<td style="width:145px;">22-415-469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Alcohol prep pads (medium)</td>
			<td style="width:87px;">PDI</td>
			<td style="width:145px;">B603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Sterile cotton-tipped applicators</td>
			<td style="width:87px;">Fisherbrand&#160;</td>
			<td style="width:145px;">23-400-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:349px;">Sterile 0.5 ml screw cap tube with caps for cells</td>
			<td style="width:87px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:145px;">1405-4700</td>
			<td>for cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Individually wrapped sterile dispo pipettes</td>
			<td style="width:87px;">Fisher</td>
			<td style="width:145px;">BD 357575</td>
			<td>for needle cleaning solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">BD insulin syringes with needles&#160;</td>
			<td style="width:87px;">Fisher</td>
			<td style="width:145px;">329461</td>
			<td>for analgesic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">70% ethanol</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td>for cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:349px;">Sterile di H2O</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td>for cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Microfuge tubes for cleaning solutions</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td>for needle cleaning solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Felt tip pen (dedicated)</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td>for marking skull</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creating anatomically accurate and reproducible intracranial xenografts of human brain tumors

Modelos de tumor ortotópico Atualmente a melhor maneira de estudar as características de um tipo de tumor, com e sem intervenção, no contexto de um animal vivo - especialmente em locais com qualidades fisiológicas e arquitectónicas únicas, tais como o cérebro in vitro e modelos ectópica não pode. responsáveis ​​por funções como a vasculatura, a barreira hemato-encefálica, metabolismo, distribuição de medicamentos e toxicidade, e uma série de outros fatores relevantes. Ortotópico modelos têm as suas limitações também, mas com células tumorais técnica adequada de interesse podem ser precisamente em vós implantada no tecido que melhor imita as condições do cérebro humano. Empregando os métodos que proporcionam volumes medidos com precisão a localizações definidas com precisão a uma taxa consistente e pressão, os modelos murinos de tumores cerebrais humanos, com taxas de crescimento previsível pode ser criado de forma reprodutível e são adequados para a análise fiável de diversas intervenções. O protocolo descrito aqui enfoca a technical detalhes de concepção e preparação para uma injeção intracraniana, a realização da cirurgia, e garantir o crescimento do tumor de sucesso e reprodutível e fornece pontos de partida para uma variedade de condições que podem ser personalizadas para uma gama de diferentes modelos de tumor cerebral.

Xenografts intracranianas confiáveis ​​podem ser criados com esta técnica descrita. Identificando as estruturas críticas do crânio do rato (Figura 1) vai permitir o reconhecimento do bregma e guiar o investigador para um local de injecção precisa e reprodutível. Nestes estudos, a linha parental U251, células U251 transfectadas com luciferase (U251-Luc), ou U87 células imortalizadas de cultura de tecidos humanos GBM foram suspensos em 4 a 6 mL de SF-DMEM e injectados 2,5 milímetros lateral ...

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Creating Anatomically Accurate and Reproducible Intracranial Xenografts of Human Brain Tumors

O cérebro é um local único, com qualidades que não são bem representados por análises in vitro ou ectópicas. Ortotópico modelos de mouse com localização e características de crescimento reprodutíveis podem ser criados de forma confiável com injeções intracranianas utilizando um instrumento de fixação estereotáxica e uma bomba de seringa de baixa pressão.

Criando anatomicamente precisos e reprodutíveis intracraniana Xenoenxertos de tumores cerebrais humanos

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

15.4K visualizações.  University of Colorado School of Medicine.  O cérebro é um local único, com qualidades que não são bem representados por análises in vitro ou ectópicas. Ortotópico modelos de mouse com localização e características de crescimento reprodutíveis podem ser criados de forma confiável com injeções intracranianas utilizando um instrumento de fixação estereotáxica e uma bomba de seringa de baixa pressão. 

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Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Estabelecimento e propagação de Tumores Humanos em Retinoblastoma Imune camundongos deficientes

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Medicina

Automated Midline Shift and Intracranial Pressure Estimation based on Brain CT Images

In this paper we present an automated system based mainly on the computed tomography (CT) images consisting of two main components: the midline shift estimation and intracranial pressure (ICP) pre-screening system. To estimate the midline shift, first an estimation of the ideal midline is performed based on the symmetry of the skull and anatomical features in the brain CT scan. Then, segmentation of the ventricles from the CT scan is performed and used as a guide for the identification of the actual midline through shape matching. These processes mimic the measuring process by physicians and have shown promising results in the evaluation. In the second component, more features are extracted related to ICP, such as the texture information, blood amount from CT scans and other recorded features, such as age, injury severity score to estimate the ICP are also incorporated. Machine learning techniques including feature selection and classification, such as Support Vector Machines (SVMs), are employed to build the prediction model using RapidMiner. The evaluation of the prediction shows potential usefulness of the model. The estimated ideal midline shift and predicted ICP levels may be used as a fast pre-screening step for physicians to make decisions, so as to recommend for or against invasive ICP monitoring.

An automated midline shift estimation and intracranial pressure (ICP) pre-screening system based on computed tomography (CT) images for patients with traumatic brain injury (TBI) is proposed using image processing and machine learning techniques.

Desvio da linha média automatizada e Estimativa Pressão Intracraniana com base em imagens do cérebro CT

In this paper we present an automated system based mainly on the computed tomography (CT) images consisting of two main components: the midline shift ...

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality treatment consisting of surgical resection, post-operative radiation therapy and temozolomide chemotherapy 1. New therapeutic approaches are clearly needed to improve patient survival and quality of life. The development of more effective treatment strategies would be aided by animal models of GBM that recapitulate human disease yet allow serial imaging to monitor tumor growth and treatment response. In this paper, we describe our technique for the precise stereotactic implantation of bio-imageable GBM cancer cells into the brains of nude mice resulting in tumor xenografts that recapitulate key clinical features of GBM 2. This method yields tumors that are reproducible and are located in precise anatomic locations while allowing in vivo bioluminescent imaging to serially monitor intracranial xenograft growth and response to treatments 3-5. This method is also well-tolerated by the animals with low perioperative morbidity and mortality.

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

We describe an integrated method for the precise, stereotactic implantation of human glioblastoma multiforme cells into the brains of nude mice and subsequent serial in vivo imaging to monitor growth and response to treatment of the resultant xenografts.

Implantação estereotáxica intracraniana e<em&gt; Em vivo</em&gt; Imaging Bioluminescent de xenoenxertos de tumores em um Sistema Modelo de Rato Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

A Novel de alta resolução<em&gt; In vivo</em&gt; Técnica de Imagem para estudar a resposta dinâmica de estruturas intracranianas ao crescimento do tumor e Terapêutica

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice

In vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate the human disease provide a valuable platform for research into disease pathophysiology and for the preclinical evaluation of novel therapies. We present a variety of methods to generate subcutaneous or orthotopic human HCC xenografts in immunodeficient mice that could be utilized in a variety of research applications. With a focus on the use of primary tumor tissue from patients undergoing surgical resection as a starting point, we describe the preparation of cell suspensions or tumor fragments for xenografting. We describe specific techniques to xenograft these tissues i) subcutaneously; or ii) intrahepatically, either by direct implantation of tumor cells or fragments into the liver, or indirectly by injection of cells into the mouse spleen. We also describe the use of partial resection of the native mouse liver at the time of xenografting as a strategy to induce a state of active liver regeneration in the recipient mouse that may facilitate the intrahepatic engraftment of primary human tumor cells. The expected results of these techniques are illustrated. The protocols described have been validated using primary human HCC samples and xenografts, which typically perform less robustly than the well-established human HCC cell lines that are widely used and frequently cited in the literature. In comparison with cell lines, we discuss factors which may contribute to the relatively low chance of primary HCC engraftment in xenotransplantation models and comment on technical issues that may influence the kinetics of xenograft growth. We also suggest methods that should be applied to ensure that xenografts obtained accurately resemble parent HCC tissues.

Human tumor xenografts in immunodeficient mice are valuable tools to study cancer biology. Specific protocols to generate subcutaneous and intrahepatic xenografts from human hepatocellular carcinoma cells or tumor fragments are described. Liver regeneration induced by partial hepatectomy in recipient mice is presented as a strategy to facilitate intrahepatic engraftment.

Geração de subcutânea e intra-hepática Humanos carcinoma hepatocelular Xenoenxertos em Immunodeficient Ratos

In  vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate  the human disease provide a valuable platform for research into disease  ...

Lesion Explorer: A Video-guided, Standardized Protocol for Accurate and Reliable MRI-derived Volumetrics in Alzheimer's Disease and Normal Elderly

Obtaining in vivo human brain tissue volumetrics from MRI is often complicated by various technical and biological issues. These challenges are exacerbated when significant brain atrophy and age-related white matter changes (e.g. Leukoaraiosis) are present. Lesion Explorer (LE) is an accurate and reliable neuroimaging pipeline specifically developed to address such issues commonly observed on MRI of Alzheimer's disease and normal elderly. The pipeline is a complex set of semi-automatic procedures which has been previously validated in a series of internal and external reliability tests1,2. However, LE's accuracy and reliability is highly dependent on properly trained manual operators to execute commands, identify distinct anatomical landmarks, and manually edit/verify various computer-generated segmentation outputs.
LE can be divided into 3 main components, each requiring a set of commands and manual operations: 1) Brain-Sizer, 2) SABRE, and 3) Lesion-Seg. Brain-Sizer's manual operations involve editing of the automatic skull-stripped total intracranial vault (TIV) extraction mask, designation of ventricular cerebrospinal fluid (vCSF), and removal of subtentorial structures. The SABRE component requires checking of image alignment along the anterior and posterior commissure (ACPC) plane, and identification of several anatomical landmarks required for regional parcellation. Finally, the Lesion-Seg component involves manual checking of the automatic lesion segmentation of subcortical hyperintensities (SH) for false positive errors.
While on-site training of the LE pipeline is preferable, readily available visual teaching tools with interactive training images are a viable alternative. Developed to ensure a high degree of accuracy and reliability, the following is a step-by-step, video-guided, standardized protocol for LE's manual procedures.

Lesion Explorer: A Video-guided, Standardized Protocol for Accurate and Reliable MRI-derived Volumetrics in Alzheimer&#039;s Disease and Normal Elderly

Lesion Explorer (LE) is a semi-automatic, image-processing pipeline developed to obtain regional brain tissue and subcortical hyperintensity lesion volumetrics from structural MRI of Alzheimer's disease and normal elderly. To ensure a high level of accuracy and reliability, the following is a video-guided, standardized protocol for LE's manual procedures.

Lesão Explorer: Um guiada por vídeo, protocolo padronizado para Volumetrics MRI derivados precisos e confiáveis ​​na doença de Alzheimer e idosos normais

Obtaining in vivo human brain tissue volumetrics from MRI is often complicated by various technical and biological issues. These challenges are ...

Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts

Orthotopic bladder cancer xenografts are the gold standard to study molecular cellular manipulations and new therapeutic agents&#160;in vivo. Suitable cell lines are inoculated either by intravesical instillation (model of nonmuscle invasive growth) or intramural injection into the bladder wall (model of invasive growth). Both procedures are complex and highly time-consuming. Additionally, the superficial model has its shortcomings due to the lack of cell lines that are tumorigenic following instillation. Intramural injection, on the other hand, is marred by the invasiveness of the procedure and the associated morbidity for the host mouse.
With these shortcomings in mind, we modified previous methods to develop a minimally invasive approach for creating orthotopic bladder cancer xenografts. Using ultrasound guidance we have successfully performed percutaneous inoculation of the bladder cancer cell lines UM-UC1, UM-UC3 and UM-UC13 into 50 athymic nude. We have been able to demonstrate that this approach is time efficient, precise and safe. With this technique, initially a space is created under the bladder mucosa with PBS, and tumor cells are then injected into this space in a second step. Tumor growth is monitored at regular intervals with bioluminescence imaging and ultrasound. The average tumor volumes increased steadily in in all but one of our 50 mice over the study period.
In our institution, this novel approach, which allows bladder cancer xenograft inoculation in a minimally-invasive, rapid and highly precise way, has replaced the traditional model.

The established technique to inoculate primary invasive orthotopic bladder cancer xenografts requires laparotomy and mobilization of the bladder. This procedure inflicts significant morbidity on the mice, is technically challenging and time-consuming. We therefore developed a high-precision, percutaneous approach utilizing ultrasound guidance.

Minimamente Invasiva Estabelecimento de murino ortotópico bexiga Xenoenxertos

Orthotopic bladder cancer xenografts are the gold standard to study molecular cellular manipulations and new therapeutic agents&#160;in vivo. Suitable ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

In Vivo Imagem Óptico de tumores cerebrais e artrite Usando fluorescente SAPC-DOPS nanovesículas

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Fast and Accurate Exhaled Breath Ammonia Measurement

This exhaled breath ammonia method uses a fast and highly sensitive spectroscopic method known as quartz enhanced photoacoustic spectroscopy (QEPAS) that uses a quantum cascade based laser. The monitor is coupled to a sampler that measures mouth pressure and carbon dioxide. The system is temperature controlled and specifically designed to address the reactivity of this compound. The sampler provides immediate feedback to the subject and the technician on the quality of the breath effort. Together with the quick response time of the monitor, this system is capable of accurately measuring exhaled breath ammonia representative of deep lung systemic levels. 
Because the system is easy to use and produces real time results, it has enabled experiments to identify factors that influence measurements. For example, mouth rinse and oral pH reproducibly and significantly affect results and therefore must be controlled. Temperature and mode of breathing are other examples. As our understanding of these factors evolves, error is reduced, and clinical studies become more meaningful. This system is very reliable and individual measurements are inexpensive. 
The sampler is relatively inexpensive and quite portable, but the monitor is neither. This limits options for some clinical studies and provides rational for future innovations.

Ammonia is an important physiologic metabolite relevant to various disease and wellness states. It is also a difficult molecule to measure in breath, which demands particular precautions be taken to obtain accurate results. Not all factors influencing ammonia are known, but progress can be difficult without accounting for these factors.

Medição Amônia ar exalado Rápido e Preciso

This exhaled breath ammonia method uses a fast and highly sensitive spectroscopic method known as quartz enhanced photoacoustic spectroscopy (QEPAS) that ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

Depleção de células do rato de xenoenxertos de tumor humano Melhora Significativamente Análise Downstream de células alvo

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...