Somos gratos ao Dr. Andrew Hollander, Sara Davis, Shuman Lee, Tim Jenkins, e Xiangsheng Dr. Xu por sua assistência especializada. Agradecemos o apoio do Dr. Ann Kennedy. BCB foi apoiado para a formação Biologia Radiação Grant C5T32CA009677. JFD foi apoiado sobre o Prémio Carreira Burroughs Wellcome para cientistas médicos (1.006.792). JLB foi apoiada sobre a concessão Supers (5 R25 CA140116-03). Nós gostaríamos de agradecer o Dr. Steve Hahn cujo incentivo e apoio ajudou a tornar possível a nossa pesquisa. Gostaríamos também de agradecer à Universidade da Pensilvânia Nano-Bio interface Center (NBIC) e Dennis Dr. Discher para o incentivo e comentários úteis. Nós reconhecemos a Facilidade de Imagem de Pequenos Animais (SAIF) da Universidade da Pensilvânia, pelo uso de suas instalações fundamentais de ressonância magnética e óptica / bioluminescência. Estas técnicas foram desenvolvidas como parte de projetos que foram apoiados pelos Institutos Nacionais de Saúde (RC1 CA145075 e K08-NS07654801).

A. Preparação pré-operatória de células tumorais <ol><li> Transduzir células U251 de glioblastoma multiforme, com um vector de expressão lentiviral (pGreenFire, Sistema Biosciences) para estavelmente expressam o gene da luciferase do pirilampo. </li><li> Estas células foram cultivadas em 10 ml de Modificação de Dulbecco completa de meio de Eagle (DMEM), que consiste de meio DMEM suplementado com soro de vitela fetal a 10%, 1% de penicilina-estreptomicina, e 1% de aminoácidos não essenciais em um frasco de cultura T75 tecido incubação a 5% de C0 2 e 37 ° C. </li><li> Realizar a cultura de células padrão, começando com a lavagem das células com tampão fosfato salino (PBS), seguido por trypsinizing. </li><li> Extingue-se a tripsina com DMEM completo, transferir a solução para um balão cónico de 50 ml, e determinar a concentração celular utilizando o Contador Coulter. </li><li> Centrifugar as células recolhidas em DMEM completo durante 3 minutos a aproximadamente 3000 revoluções por minuto. </li><li> Após a centrifugação, aspirar def os meios de comunicação, deixando apenas um pellet de células no fundo do frasco cónico de 50 ml. </li><li> Trabalhando rapidamente para evitar que as células de secar, voltar a suspender as células num volume de fresco de DMEM completo para obter a concentração pretendida de 50.000 células / uL e transferir para um frasco de 2 ml estéreis colocados em gelo. </li><li> Células no gelo deve ser brevemente agitadas em um nível baixo a cada ~ 20 min para impedir a adesão celular. As células podem ser utilizadas com segurança para implantes intracranianos de até duas horas após a colocação em gelo. </li></ol> B. Implantação heteróloga ortotópico <ol><li> Pesar nu atímicos NCr mouse (nu / nu) para estabelecer uma linha de base, peso pré-implantação. Nós geralmente selecionar ratos 6-10 semanas de idade com peso entre 17 e 24 gramas. </li><li> 1 h antes da implantação, pré-medicar o rato com 5 mg / kg de não-esteróides anti-inflamatórios de meloxicam por meio de injecção subcutânea para o tratamento de dor pós-operatória e inflamação. </li><li> Anesthetize o animal com uma injecção intraperitoneal de uma mistura de cetamina / xilazina na dose de 140 mg / kg e 10 mg / kg, respectivamente. </li><li> Confirmar que o mouse é suficientemente anestesiado por avaliação da resposta espontânea do animal a uma pitada do dedo do pé. Se o animal responde a pitada do dedo do pé, atrasar o procedimento até que a anestesia pode ter efeito ou considerar injeção de anestesia adicional (&lt;25% do valor original). </li><li> Prepare o rato anestesiado para posicionamento no Digital Stoelting Apenas para plataforma Rato estereotáxica (Stoelting Inc.) ligando os dentes do rato incisivos na barra de mordida do limitador focinho e apertar a braçadeira de nariz sobre o focinho, assegurando que a cabeça do rato está em um plano de nível. </li><li> Transferir o rato contido na plataforma estereotáxica Stoelting, ajustando a posição do animal, de modo que as pontas das orelhas são barras na extremidade caudal do canal auditivo. Após o posicionamento do animal crânio-a-caudal foi adjusTed, garantir a barra de mordida para o quadro estereotáxico. O rato deve ser assente numa placa de aquecimento firme plástico (Harvard Apparatus) fixado com fita para a plataforma Stoelting para fornecer feedback controlado regulação da temperatura durante a cirurgia. </li><li> Ajuste a altura das barras de ouvido, se necessário e, em seguida, avançar as barras de ouvido na parte caudal do canal do ouvido, prendendo-os de tal forma que a cabeça do rato está em um nível plano e imobilizado no toque de dedo. Monitorar cuidadosamente para sinais de desconforto respiratório após a colocação das barras de ouvido. Solte e re-posição se o animal está em perigo. </li><li> Introduzir a ponta lubrificada de uma sonda de temperatura rectal ligado ao controlador de temperatura TCAT-2DF (Harvard Apparatus) para monitorar a temperatura do animal e para proporcionar controlo de realimentação para a placa de aquecimento posicionado por baixo do rato para manter a temperatura do corpo do animal a 36 ° C durante o procedimento. </li><li> Aplicar pomada oftálmica para os olhos para Prevent secagem. </li><li> Aplicar a solução de betadine para o topo da cabeça do rato para desinfectar o local de incisão, tendo o cuidado de evitar os olhos. </li><li> Realizar uma pitada de igual para confirmar o rato está inconsciente, proporcionando uma pequena quantidade adicional de cetamina / xilazina (&lt;25% da dose inicial) quando necessário. </li><li> Limpar a 0,45 milímetros broca rebarba (Stoelting) ligado à broca (Foredom Microdrill), utilizando uma compressa de álcool e, em seguida esterilizar a broca numa esfera de vidro esterilizador (Germinator 500, CellPoint Scientific) durante 15 seg, imergindo apenas o bit de perfuração em os grânulos de esterilizador. </li><li> Utilizando um bisturi esterilizado, fazer uma incisão 0,75 centímetros longitudinalmente na metade do couro cabeludo, que se estende desde o nível dos olhos cauda. Confirmar a visualização do bregma. </li><li> Fixar o suporte à plataforma de perfuração Stoelting e coloque uma broca (Foredom Microdrill) com uma broca 0,45 milímetros rebarba (Stoelting) no suporte da broca, prendendo-o na posição correcta. </li><li> Coloque a broca exatamente sobre tele bregma e zero-a x, y, z coordenadas do visor estereotaxia digital. Move a ponta da broca para a posição 2 milímetros posterior e 1,5 mm lateral à bregma no hemisfério cerebral direito e broca no crânio do animal com a broca Foredom, perfurando apenas o osso. Uma mecha de algodão estéril, pode ser usado para suavemente retrair as bordas da incisão para facilitar a visualização do crânio. </li><li> Remover a broca de perfuração e o suporte da plataforma estereotáxica. </li><li> Anexar o Nanomite injector da bomba de seringa (Harvard Apparatus) para a plataforma estereotáxica. </li><li> Remover as células de gelo e, ou vórtice suavemente o frasco contendo as células tumorais com pulsos breves ou suavemente apertar o frasco para re-suspender as células. Desenha-se 7 uL da suspensão de células através de uma agulha de calibre 30 um chanfro &quot;longa e plana ligada a uma seringa de 10 ul (Hamilton seringa). Evite grandes bolhas de ar na seringa. Assegurar que não existem bolhas de ar na pi 6 inicial de fluido which será o volume total injectado no rato. Pequenas bolhas de ar no ul uma restantes são de nenhum interesse. Evite a repetição de draw-ups da suspensão de células, se possível para minimizar os danos às células. </li><li> Posicionar a seringa carregada no injector de seringa. Usando uma compressa de álcool, remover todo o líquido de suspensão de células que aparecem na ponta da agulha, para evitar a contaminação do local da incisão com as células cancerosas que podem resultar em crescimento do tumor, no espaço extracranianas. </li><li> Definir a bomba do injector para proporcionar 6,0 uL, a uma taxa de 0,5 uL / ​​min. O pi 1 de suspensão de células remanescente na seringa após a implantação garante que as bolhas de ar que frequentemente recolhem na seringa não são injectados no animal. Injecção de bolhas de ar pode resultar em uma embolia de ar fatal. </li><li> Avançar a agulha da seringa no orifício de trepanação manter a agulha perpendicular (90 graus) com o crânio. Uma vez que a agulha atravessou o crânio, zero a coordinates no visor estereotaxia digital e depois lentamente avançar a ponta da agulha ao longo de um período de 4 minutos até atingir uma profundidade de 2,5 mm. A agulha passa através do córtex e do hipocampo porções posterior. O x, y, z coordenadas estereotáxicas para implantação foram escolhidos para gerar um tumor lateralmente posicionado dentro do hemisfério cerebral, evitando danos às estruturas cerebrais críticas, tais como a proximidade do tálamo e para os ventrículos, reduzindo assim a probabilidade de sementeira do líquido cefalorraquidiano com células tumorais que pode dar origem a indesejáveis ​​tumores medulares. A localização posterior em relação ao bregma foi seleccionada para reduzir a probabilidade de um tumor grande, localmente avançado ulcerativa na órbita. Pausa com a agulha a uma profundidade de 2 min e, em seguida, iniciar a implantação de células. </li><li> Durante a implantação, secar o crânio repetidamente com uma lança de esponja de microcirurgia para remover qualquer líquido contendo tumor que pode ter refluxo para fora do orifício de trepanação duranteimplantação. Evite interromper a agulha com a esponja de microcirurgia. A remoção deste líquido deve reduzir a probabilidade de crescimento do tumor, no espaço extracranianas. </li><li> Após a injecção está completa, deixar a agulha no cérebro durante 2 min e, em seguida, lentamente, retirar a agulha ao longo de um período de 3-4 min. </li><li> Solte os bares de ouvido e retentoras focinho e remover o mouse do aparelho estereotáxica. </li><li> Fechar o orifício de trepanação no crânio com cera de osso estéril depositado por esfregando cera e para trás através do orifício de trepanação do fim de madeira de um aplicador com ponta de algodão estéril. Continuar a aplicar a cera de osso até que o furo é completamente selado e a cera de osso vedar o orifício de trépano é nivelada com o crânio adjacente. </li><li> Re-aproximar as bordas da incisão com cotonetes de algodão estéril e aplicar cola de tecido para selar veterinária a ferida, tendo o cuidado para evitar a exposição de cola para os olhos do animal. </li><li> Por último, coloque o mouse sobre uma almofada de aquecimento definida para 37 °C até que o animal recupera a consciência. Transferir o animal de volta para sua gaiola original, uma vez que o mouse está alerta e receptivo. </li></ol> C. Bioluminescent Imaging (BLI) para acompanhar o crescimento do tumor e resposta à terapia Breves instruções seguem para a imagem de bioluminescência. <ol><li> Anestesiar ratos previamente implantados com tumor em uma câmara com 2% de isoflurano e oxigênio. </li><li> Quando os ratos são anestesiados, injecta-los por via subcutânea ou por via intraperitoneal com 60 ul de D-luciferina sal de potássio diluído em PBS para uma concentração de 50 mg / ml. </li><li> Ligue o fluxo de anestesia para os cones de nariz do digitalizador de imagem de bioluminescência e rapidamente transferir os ratos para o scanner colocando os focinhos dos cones de ogiva. </li><li> Posicionar divisórias pretas entre os ratos para limitar a hemorragia de sinal a partir de um tumor bioluminescente com alta intensidade de sinal para um sinal de tumor adjacente com muito menor. </li><li> Usoo software Image estar, tomar frequentes exposições em série por um período total de até 30 min após o momento da injecção de D-luciferina. Somos a favor de definir o tempo de exposição para &quot;Auto&quot; para limitar a probabilidade de uma imagem sob ou sobre-exposto. Nenhuma exposição única deve ser&gt; 5 min. </li><li> Realize repetir imagem de bioluminescência em intervalos apropriados. Imagem semanal de série é uma opção razoável para muitos experimentos longitudinais teste de resposta ao tratamento. </li><li> Após a aquisição das imagens, utilizar o programa de software para analisar Imagem vivo de tumores através da elaboração de uma região de interesse (ROI) em torno de cada tumor em cada imagem adquirida durante a sessão de imagiologia bioluminescente. Aplicar uma região, segundo e menor de interesse para o flanco inferior de cada rato em cada imagem como uma região de fundo de interesse para corrigir o sinal bioluminescente do tumor em função do grau de intensidade do sinal de fundo bioluminescente. Nós preferimos usar o &quot;Radiance&quot; configuração em vez de &quot;conta&quot; como a saídavalores de sinal bioluminescente. </li><li> Exportar os resultados de ROI em Excel e determinar o sinal de fundo ajustado máximo bioluminescente para cada rato. </li><li> Repita imagiologia bioluminescente, tal como indicado para a monitorização do crescimento do tumor em série. Em nossos experimentos, executamos BLI semanal. Nós preferimos que determina o sinal de BLI máxima para uma sessão de imagem tomado como exposições constantes ao longo de 5 - 30 min após a injecção de D-luciferina. </li></ol> D. Representante Resultados Esta técnica de implante estereotáxica está associada com uma taxa de sucesso de tumor ter de 90-100% e com baixa mortalidade perioperatória, geralmente menos do que 5%. O risco de efeitos secundários indesejáveis ​​é baixa, com esta técnica, incluindo complicações como a semeadura da medula espinal a partir de células de tumor implantadas nos ventrículos, ou o crescimento do tumor a partir de qualquer extracraniana semeadura da incisão com células tumorais ou de encerramento inadequado do orifício de trépano umllowing tumor intracraniano de expansão, através da abertura no crânio. Análise ex vivo de xenoenxertos de tumores demonstraram zonas previstas de hipóxia, o aumento da expressão de VEGF e necrose. Microscopia de fluorescência para a proteína fluorescente verde (GFP), expressos de forma estável por nossa linha celular GBM revelou a natureza infiltrativa destes xenoenxertos. A Figura 1 mostra os resultados de uma implantação estereotáctica típica bem sucedida de células de GBM para o cérebro de um rato. Esta é uma varredura do cérebro T2 ressonância magnética de um cérebro de camundongo realizada com um ímã Tesla 9,4 21 dias após a implantação com a técnica descrita aqui. Figura 1 revela um único foco de tumor no hemisfério direito (contorno na cor rosa), medindo 19 milímetros 3 que se localiza as coordenadas precisas do local de implantação. A Figura 2 mostra os resultados de imagiologia bioluminescente usando o techn<html> iques aqui descrito para um grupo de 10 ratinhos com tumores implantados estereotaxicamente que estavam uniformemente estratificada com base na intensidade de sinal máxima bioluminescente para receber ou irradiação craniana (4 x 4 Gy fracções diárias) ou nenhum tratamento. Nesta experiência, imagiologia bioluminescente mostra que a terapia de radiação inibe a proliferação dos tumores implantados, resultando em nenhum aumento no sinal detectado bioluminescente, enquanto que o sinal aumenta substancialmente em tumores mock-irradiados de controlo, devido a proliferação incontrolada de células cancerosas. Figura 1 (Vídeo). Coronal seções de ressonância magnética de um cérebro de camundongo contendo um U251 tumor glioblastoma multiforme com contorno do volume do tumor (em rosa). A varredura foi realizada em um spin-eco protocolo T2 ponderado em um scanner Tesla 9.4. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4089/4089movie1.m4v" target="_blank">Clique aqui para ver filme</a> . re 2 &quot;src =&quot; files/ftp_upload/4089/4089fig2.jpg / &quot;/&gt; Figura 2. 10 ratinhos com tumores implantados estereotaxicamente glioblastoma multiforme foram tratados com terapia de feixe externo de radiação a 16 Gy em fracções de 4 ou nenhum tratamento. Ratos foram fotografadas com imagiologia bioluminescente, antes do tratamento e semanalmente após o início do tratamento. O gráfico apresenta a bioluminescência relativo calculado como a mudança de dobragem mediana onde a mudança de dobragem é definida como a razão entre o valor de corrente máxima para BLI pré-tratamento BLI valor máximo.

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	<li>Stupp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma.">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> N. Engl. J. Med. 352, 987-996 (2005).</li><li>Jacobs, V. L., Valdes, P. A., Hickey, W. F., De Leo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+review+of+in+vivo+GBM+rodent+models:+emphasis+on+the+CNS-1+tumour+model.">Current review of in vivo GBM rodent models: emphasis on the CNS-1 tumour model.</a> ASN Neuro. 3, e00063 (2011).</li><li>Shelton, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+pre-clinical+in+vivo+mouse+model+for+malignant+brain+tumor+growth+and+invasion.">A novel pre-clinical in vivo mouse model for malignant brain tumor growth and invasion.</a> J. Neurooncol. 99, 165-176 (2010).</li><li>Brehar, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+xenograft+glioblastoma+implants+in+nude+mice+brain.">The development of xenograft glioblastoma implants in nude mice brain.</a> J. Med. Life. 1, 275-286 (2008).</li><li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Intracranial+Brain+Tumor+Xenografts+With+Subsequent+Analysis+of+Tumor+Growth+and+Response+to+Therapy+using+Bioluminescence+Imaging.">Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging.</a> J. Vis. Exp. (41), e1986 (2010).</li><li>Radaelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistopathological+and+neuroimaging+characterization+of+murine+orthotopic+xenograft+models+of+glioblastoma+multiforme+recapitulating+the+most+salient+features+of+human+disease.">Immunohistopathological and neuroimaging characterization of murine orthotopic xenograft models of glioblastoma multiforme recapitulating the most salient features of human disease.</a> Histol. Histopathol. 24, 879-891 (2009).</li><li>Baumann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+efficacy+of+drug-loaded+nanocarriers+against+brain+tumors+by+targeted+radiation+therapy.">Enhancing the efficacy of drug-loaded nanocarriers against brain tumors by targeted radiation therapy.</a> , (2012).</li><li>Baumann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+method+for+reproducible+and+accurate+image-guided+stereotactic+cranial+irradiation+of+brain+tumors+using+the+Small+Animal+Radiation+Research+Platform+(SARRP).">An integrated method for reproducible and accurate image-guided stereotactic cranial irradiation of brain tumors using the Small Animal Radiation Research Platform (SARRP).</a> Transl. Oncol. , (2012).</li><li>Park, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroPET/CT+imaging+of+an+orthotopic+model+of+human+glioblastoma+multiforme+and+evaluation+of+pulsed+low-dose+irradiation.">MicroPET/CT imaging of an orthotopic model of human glioblastoma multiforme and evaluation of pulsed low-dose irradiation.</a> Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 80, 885-892 (2011).</li><li>Szentirmai, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescence+imaging+of+luciferase+expressing+intracranial+U87+xenografts:+correlation+with+magnetic+resonance+imaging+determined+tumor+volume+and+longitudinal+use+in+assessing+tumor+growth+and+antiangiogenic+treatment+effect.">Noninvasive bioluminescence imaging of luciferase expressing intracranial U87 xenografts: correlation with magnetic resonance imaging determined tumor volume and longitudinal use in assessing tumor growth and antiangiogenic treatment effect.</a> Neurosurgery. 58, 365-372 (2006).</li><li>Dinca, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+monitoring+of+intracranial+glioblastoma+xenograft:+response+to+primary+and+salvage+temozolomide+therapy.">Bioluminescence monitoring of intracranial glioblastoma xenograft: response to primary and salvage temozolomide therapy.</a> J. Neurosurg. 107, 610-616 (2007).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método de implantação estereotáxica de células de cancro em ratinhos descritos neste documento de forma reprodutível gera tumores que razoavelmente recapitulam o padrão de infiltração e rápida de crescimento do glioblastoma multiforme clínico 2, 6-8. Esta técnica é especialmente bem adequado para as experiências ratinhos estratificando uniformemente para diferentes grupos de tratamento em que os tumores de tamanho comparável reprodutíveis e propriedades biológicas e em localizações anató...

<table border="1"><tbody><tr><td> Descrição </td><td> Fornecedor </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Digital Apenas para Rato Instrumento Estereotáxica </td><td> Stoelting </td><td> 51730D </td><td> Plataforma estereotáxica para implantação do mouse </td></tr><tr><td> De cetamina / xilazina </td><td></td><td></td><td> Anestesia injetável </td></tr><tr><td> Puralube Pomada Vet (oftálmica) </td><td> Amazon.com </td><td></td><td> Para evitar a secagem dos olhos do rato </td></tr><tr><td> perfurar titular para a plataforma estereotáxica </td><td> Stoelting </td><td> 51681 </td><td></td></tr><tr><td> Broca Micromotor </td><td> Stoelting </td><td> 51449 </td><td> Para perfurar o crânio </td></tr><tr><td> 0,45 milímetros broca de carboneto </td><td> Stoelting </td><td> 514551 </td><td></td></tr><tr><td> Cotonetes estéreis </td><td> Fisher Scientific </td><td> 23-400-100 </td><td></td></tr><tr><td> Conta de vidro seco esterilizador (Germinator 500) </td><td> Braintree Científica </td><td> GER-5287 </td><td> Para esterilizar instrumentos cirúrgicos metálicos </td></tr><tr><td> Rato retal sonda </td><td> Braintree Científica </td><td> RET-3-ISO </td><td> Compatível com o controlador de temperatura </td></tr><tr><td> Controlador de temperatura (TCAT-2DF) </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 727561 </td><td> Controlador de temperatura para manter a temperatura do animal durante a cirurgia </td></tr><tr><td> Pequena placa de aquecimento </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 727617 </td><td> Para uso com o controlador de temperatura para aquecer rato durante a cirurgia. A placa de aquecimento se encaixa sob o mouse sobre a plataforma estereotáxica. </td></tr><tr><td> Bisturis descartáveis </td><td> BD Bard-Parker </td><td> 2015-11 </td><td> º 10 bisturi </td></tr><tr><td> Seringa de 10 microlitros </td><td> Hamilton </td><td> 7635-01 </td><td> Para a injecção de células tumorais </td></tr><tr><td> 30 agulhas de calibre, 1 &quot;de comprimento, com ponto liso </td><td> Hamilton </td><td> Vário </td><td> Deve ser compatível com a seringa de 10 ul </td></tr><tr><td> Nanomite bomba de seringa programáveis </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 704507 </td><td> Digital motorizado seringa injetora para o dispositivo estereotáxico </td></tr><tr><td> Celulose estéreis cirúrgicos esponjas lança </td><td> Ultracell </td><td> 40410 </td><td> Para secar o campo cirúrgico </td></tr><tr><td> Cera de osso </td><td> Ethicon </td><td> W31 </td><td> Para selar o furo da rebarba </td></tr><tr><td> Tissumend II adesivo de tecido sintético absorvível </td><td> Laboratórios veterinários </td><td> 3002931 </td><td> Para selar a incisão </td></tr><tr><td> Bomba de água quente com a almofada de aquecimento </td><td> Gaymar </td><td> TP-650 </td><td> Aquece ratos no período pós-operatório </td></tr><tr><td> IVIS Lumina II </td><td> Caliper Life Science </td><td></td><td> Bioluminescent imager </td></tr><tr><td> D-luciferina sal de potássio </td><td> Biotecnologia ouro </td><td> SORTE-1 </td><td> Luciferina para bioluminescente de imagem </td></tr></tbody></table>

stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) é um alto grau de cancro cerebral primário com uma sobrevida média de apenas 14,6 meses em humanos, apesar do tratamento modalidade tri-padrão consiste na ressecção cirúrgica, pós-operatório de radioterapia e quimioterapia temozolomida 1. Novas abordagens terapêuticas são claramente necessárias para melhorar a sobrevida do paciente e qualidade de vida. O desenvolvimento de estratégias mais eficazes de tratamento seria auxiliada por modelos animais de GBM que recapitular doença humana ainda permitir imagens em série para acompanhar o crescimento do tumor e resposta ao tratamento. Neste artigo, descrevemos a nossa técnica para a implantação estereotáxica precisa de bio-representável células cancerosas GBM no cérebro de camundongos nude, resultando em xenotransplantes tumorais que recapitulam principais características clínicas da GBM 2. Este método produz tumores que são reprodutíveis e estão localizados em locais anatómicos precisos, permitindo simultaneamente in vivo imaging bioluminescente para monitorar intra serialmentecrescimento de xenoenxertos de crânio e resposta a tratamentos 3-5. Este método também é bem tolerado pelos animais com morbilidade e mortalidade perioperatória baixo.

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Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Nós descrevemos um método integrado para a implantação, precisa estereotáxica de células de glioblastoma multiforme humano no cérebro de camundongos nude e série subseqüente<em&gt; In vivo</em&gt; De imagem para monitorizar o crescimento e a resposta ao tratamento dos xenoenxertos resultantes.

Implantação estereotáxica intracraniana e<em&gt; Em vivo</em&gt; Imaging Bioluminescent de xenoenxertos de tumores em um Sistema Modelo de Rato Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality ...

stereotactic-intracranial-implantation-vivo-bioluminescent-imaging

Research

JoVE Journal

Medicine

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

25.4K visualizações.  University of Pennsylvania. Nós descrevemos um método integrado para a implantação, precisa estereotáxica de células de glioblastoma multiforme humano no cérebro de camundongos nude e série subseqüente In vivo De imagem para monitorizar o crescimento e a resposta ao tratamento dos xenoenxertos resultantes.

Vídeo: Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-fotão imagem de invasão das células tumorais em um modelo de camundongo ortotópico de carcinoma epidermóide oral

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Medicina

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

Na imagem de bioluminescência vivo Tumor de mama Dynamics Hipóxia metástase do cancro cerebral em um modelo de rato

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate since the advent of in vivo bioluminescent imaging technologies 1-3. Indeed, the ability to locate and quantify tumor growth longitudinally in a single cohort of animals to completion of the study as opposed to sacrificing individual groups of animals at specific assay times has revolutionized how researchers investigate breast cancer metastasis. Unfortunately, current methodologies preclude the real-time assessment of critical changes that transpire in cell signaling systems as breast cancer cells (i) evolve within primary tumors, (ii) disseminate throughout the body, and (iii) reinitiate proliferative programs at sites of a metastatic lesion. However, recent advancements in bioluminescent imaging now make it possible to simultaneously quantify specific spatiotemporal changes in gene expression as a function of tumor development and metastatic progression via the use of dual substrate luminescence reactions. To do so, researchers take advantage for two light-producing luciferase enzymes isolated from the firefly (Photinus pyralis) and sea pansy (Renilla reniformis), both of which react to mutually exclusive substrates that previously facilitated their wide-spread use in in vitro cell-based reporter gene assays 4. Here we demonstrate the in vivo utility of these two enzymes such that one luminescence reaction specifically marks the size and location of a developing tumor, while the second luminescent reaction serves as a means to visualize the activation status of specific signaling systems during distinct stages of tumor and metastasis development. Thus, the objectives of this study are two-fold. First, we will describe the steps necessary to construct dual bioluminescent reporter cell lines, as well as those needed to facilitate their use in visualizing the spatiotemporal regulation of gene expression during specific steps of the metastatic cascade. Using the 4T1 model of breast cancer metastasis, we show that the in vivo activity of a synthetic Smad Binding Element (SBE) promoter was decreased dramatically in pulmonary metastasis as compared to that measured in the primary tumor 4-6. Recently, breast cancer metastasis was shown to be regulated by changes within the primary tumor microenvironment and reactive stroma, including those occurring in fibroblasts and infiltrating immune cells 7-9. Thus, our second objective will be to demonstrate the utility of dual bioluminescent techniques in monitoring the growth and localization of two unique cell populations harbored within a single animal during breast cancer growth and metastasis.

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Herein we describe the methods to construct, visualize, and quantify the bioluminescent reactions of both firefly and renilla luciferase enzymes expressed in metastatic breast cancer cells during their growth and metastasis in vivo.

In vivo dupla Substrato Bioluminescent imagem

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate ...

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The cell line was originally induced by intracranial injection of 3-methyl-cholantrene into a C57BL/6 syngeneic mouse strain 1; therefore, immunologically competent C57BL/6 mice can be used. While we use GL261, the following protocol can be used for the implantation and monitoring of any intracranial mouse tumor model. GL261 cells were engineered to stably express firefly luciferase (GL261-luc). We also created the brighter GL261-luc2 cell line by stable transfection of the luc2 gene expressed from the CMV promoter. C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr mice (albino variant of C57BL/6) from the National Cancer Institute, Frederick, MD were used to eliminate the light attenuation caused by black skin and fur. With the use of albino C57BL/6 mice; in vivo imaging using the IVIS Spectrum in vivo imaging system is possible from the day of implantation (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). The GL261-luc and GL261-luc2 cell lines showed the same in vivo behavior as the parental GL261 cells. Some of the shared histological features present in human GBMs and this mouse model include: tumor necrosis, pseudopalisades, neovascularization, invasion, hypercellularity, and inflammation 1.
Prior to implantation animals were anesthetized by an intraperitoneal injection of ketamine (50 mg/kg), xylazine (5 mg/kg) and buprenorphine (0.05 mg/kg), placed in a stereotactic apparatus and an incision was made with a scalpel over the cranial midline. A burrhole was made 0.1mm posterior to the bregma and 2.3mm to the right of the midline. A needle was inserted to a depth of 3mm and withdrawn 0.4mm to a depth of 2.6mm. Two &mu;l of GL261-luc or GL261-luc2 cells (107 cells/ml) were infused over the course of 3 minutes. The burrhole was closed with bonewax and the incision was sutured.
Following stereotactic implantation the bioluminescent cells are detectable from the day of implantation and the tumor can be analyzed using the 3D image reconstruction feature of the IVIS Spectrum instrument. Animals receive a subcutaneous injection of 150&mu;g luciferin /kg body weight 20 min prior to imaging. Tumor burden is quantified using mean tumor bioluminescence over time. Tumor-bearing mice were observed daily to assess morbidity and were euthanized when one or more of the following symptoms are present: lethargy, failure to ambulate, hunched posture, failure to groom, anorexia resulting in &gt;10% loss of weight. Tumors were evident in all of the animals on necropsy.

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

Intracranial implantation of GL261 cells into C57BL/6 mice produces malignant gliomas that recapitulate many of the hallmarks of human glioblastoma multiforme. We used GL261 cells stably expressing luciferase to allow us to use in vivo imaging to follow tumor progression. The surgery and 3D in vivo imaging are demonstrated.

Implantação intracraniana com 3D subseqüentes In Vivo Bioluminescent imagem de Gliomas murino

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

Viver de imagem de Respostas de drogas no microambiente tumoral em modelos do rato do cancro da mama

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

Despite the considerable progress made in the stent development in the last decades, cardiovascular diseases remain the main cause of death in western countries. Beside the benefits offered by the development of different drug-eluting stents, the coronary revascularization bears also the life-threatening risks of in-stent thrombosis and restenosis. Research on new therapeutic strategies is impaired by the lack of appropriate methods to study stent implantation and restenosis processes. Here, we describe a rapid and accessible procedure of stent implantation in mouse carotid artery, which offers the possibility to study in a convenient way the molecular mechanisms of vessel remodeling and the effects of different drug coatings.

A model of stent implantation in mouse carotid artery is described. Compared to other similar methods, this procedure is very rapid, simple and accessible, offering the possibility to study in a convenient way the vascular wall reaction to different drug-eluting stents and the molecular mechanisms of restenosis.

Um modelo murino de implante de stent na artéria carótida para o Estudo da reestenose

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

A Novel de alta resolução<em&gt; In vivo</em&gt; Técnica de Imagem para estudar a resposta dinâmica de estruturas intracranianas ao crescimento do tumor e Terapêutica

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In vivo 19 F MRI para Rastreamento celular

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Creating Anatomically Accurate and Reproducible Intracranial Xenografts of Human Brain Tumors

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live animal &#8211;&#160;particularly in sites with unique physiological and architectural qualities such as the brain. In vitro and ectopic models cannot account for features such as vasculature, blood brain barrier, metabolism, drug delivery and toxicity, and a host of other relevant factors. Orthotopic models have their limitations too, but with proper technique tumor cells of interest can be accurately engrafted into tissue that most closely mimics conditions in the human brain. By employing methods that deliver precisely measured volumes to accurately defined locations at a consistent rate and pressure, mouse models of human brain tumors with predictable growth rates can be reproducibly created and are suitable for reliable analysis of various interventions. The protocol described here focuses on the technical details of designing and preparing for an intracranial injection, performing the surgery, and ensuring successful and reproducible tumor growth and provides starting points for a variety of conditions that can be customized for a range of different brain tumor models.

The brain is a unique site with qualities that are not well represented by in vitro or ectopic analyses. Orthotopic mouse models with reproducible location and growth characteristics can be reliably created with intracranial injections using a stereotaxic fixation instrument and a low pressure syringe pump.

Criando anatomicamente precisos e reprodutíveis intracraniana Xenoenxertos de tumores cerebrais humanos

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

Telemetria Intrauterine medir Rato contrátil Pressão<em&gt; In Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...