Para começar, coloque o rato eutanasiado na superfície de dissecção com o lado ventral para cima. Aperte a camada da pele com pinças estéreis e faça cortes ao nível da superfície, evitando danos aos órgãos internos. Usando uma tesoura de dissecção grande e afiada, faça um corte longitudinal no nível da superfície no centro do abdômen.
Em seguida, a partir desse corte, faça dois cortes horizontais mais curtos, um de cada lado. Usando pinças, descasque a pele para expor a cavidade abdominal. Corte através da membrana peritoneal para expor totalmente os órgãos internos na cavidade abdominal com pronto acesso ao intestino.
Com tesoura e pinça, localize o estômago e identifique o duodeno, aproximadamente dois a três centímetros distal a ele, que aparece como um segmento amarelado. O jejuno proximal está localizado aproximadamente quatro a cinco centímetros distal ao ligamento de Treitz. Um marco entre o duodeno e o jejuno.
Coloque o fragmento intestinal isolado em uma placa de Petri de 10 centímetros. Lavar o segmento intestinal desejado do mesentério com 10 mililitros de PBS gelado até limpar o conteúdo luminal. Em um papel toalha, corte o segmento intestinal em pedaços de dois centímetros de comprimento.
Em seguida, abra cada peça intestinal longitudinalmente para expor o epitélio. Raspe a superfície luminal exposta usando uma lâmina de microscópio de vidro para remover as vilosidades. Coloque os pedaços intestinais na solução de EDTA sobre gelo e gire-a quatro graus Celsius por 30 minutos em um revólver de tubo regulado para 10 RPM.
No microscópio de dissecação, despeje o conteúdo do tubo em uma placa de Petri de 10 centímetros. Adicione mais cinco mililitros de PBS gelado. Usando pinças finas, segure um segmento intestinal e agite vigorosamente para observar a liberação do epitélio no PBS.
Inicialmente, o PBS conterá principalmente vilosidades. Agite os fragmentos intestinais continuamente, descarte periodicamente o PBS contendo vilosidades e adicione 10 mililitros de PBS fresco aos fragmentos intestinais. Continue a agitar os fragmentos e repita a etapa de lavagem do PBS até que as vilosidades não sejam mais liberadas no PBS.
Mas, em vez disso, o PBS contém principalmente criptas. Descarte os fragmentos intestinais remanescentes e enriqueça o PBS restante na placa de Petri para criptas intestinais. Em uma capa de cultura de tecidos, colete o PBS contendo criptas e filtre através de um drenador de células de 70 mícrons.
Centrifugar o filtrado a 250 x g durante cinco minutos. Em seguida, remova seu sobrenadante e ressuspenda o pellet em cinco milímetros de DMEM plus avançado. Centrifugar novamente a 250 x g durante cinco minutos.
E retire o sobrenadante, deixando 50 microlitros de meio com o pellet. Ressuspender o pellet no meio restante e adicioná-lo à alíquota do extrato da matriz extracelular ou EME sobre gelo. Pipete suavemente para cima e para baixo para suspender as criptas uniformemente em todo o EME, evitando fazer bolhas.
Coloque 50 microlitros das cúpulas EME em uma placa de cultura de tecidos de 35 milímetros. Um incubado 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 20 minutos. Após a incubação, adicionar dois mililitros de meio organoide intestinal de rato, ou RIOM, contendo 10 micromolares cada de Y27632 e CHIR99021.
Em seguida, para passar organoides intestinais de ratos, aspirar o meio de uma placa contendo organoides e adicionar um mililitro de reagente de dissociação para liberar os organoides das cúpulas EME. Transfira o reagente de dissociação com organoides fragmentados para um tubo cônico de 15 mililitros. Lave a placa de cultura com dois mililitros de DMEM plus avançado e adicione-a ao tubo cônico de 15 mililitros contendo os organoides fragmentados.
Usando uma pipeta de pastagem de vidro, pipetar suavemente para cima e para baixo 15 a 20 vezes para fragmentar os organoides. Centrifugar os organoides a 350 x g durante dois minutos e adicionar 50 microlitros de solução do fundo do tubo para o EME. Depois de misturar a solução, pranche 50 microlitros das cúpulas EME em uma placa de cultura de tecido de 35 milímetros e incube a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 20 minutos.
Após a incubação, adicionar dois mililitros de RIOM contendo 10 micromolares cada de Y27632 e CHIR99021. Imagens representativas de fragmentos de vilosidades e criptas são mostradas. As criptas são menores em tamanho em comparação com as vilosidades.
As criptas chapeadas se expandem nos próximos dias e começam a brotar e se diferenciar nos dias quatro a sete. Após dois dias de descongelamento, uma cultura organoide saudável mostrou a presença de esferoides e organoides brotados. A mesma linha organoide após a passagem mostrou a presença de domínios semelhantes a criptas únicas.
