O fígado é o maior órgão dos mamíferos. Desempenha um papel muito importante no metabolismo e na desintoxicação. Embora o fígado tenha uma notável capacidade de regeneração in vitro, ainda é um desafio muito grande para um longo prazo cultivar hepatócito in vitro.
Aqui, estabelecemos os organoides hepatócitos de hepatócitos maduros. Mantém as principais características dos hepatócitos na morfologia e na função. Neste vídeo, vamos introduzir como cultivar e passar esses organoides e como realizar a modificação genética desses organoides em detalhes.
Primeiro, perfusão hepática e digestão. Prepare todas as regiões e os instrumentos e os torne estéreis. Lave o rato e abra o epidérmico e a pele, e depois tente encontrar o forno de bolsa do fígado.
Injete as agulhas nele, e então capture isso. Faça a perfusão à velocidade de cinco mililitros por minuto, até que o fígado fique pálido. Transforme-os no tampão de perfusão, coloque cuidadosamente, observe o fígado, até que fique macio.
Normalmente leva de três a cinco minutos, depois corte o fígado e coloque-os nas placas, e corte-os em pequenos pedaços com a tesoura. Pep-lo para cima e para baixo com frequência. Normalmente, leva de 10 a 15 minutos para transformá-los na única célula.
E então pep-lo para cima e para baixo com 10 a 15 minutos e alimentá-los através do montador. Transformá-los nas células individuais. Colete todas as células no tubo de 50 mililitros, e centrífuga-as, com a velocidade e, em seguida, colete todas as placas por.
Tente mantê-los sempre no gelo frio. Faça as suspensões de célula única e conte-as com o contador de células. Normalmente os hepatócitos se felizes, tem o fluorescente animado.
Na segunda parte, tentamos sentar as células e fazer a cultura organoide. Coletamos todas as suspensões das células, e contamos as células com uma certa fusão de concentro e então misturamos a. Os Metrogels. e o meio de código.
Normalmente tomamos, com o médio e os metrogels, na proporção de 1 a 2 ou 1 a 3. Depois de misturá-los cuidadosamente, sentamos-nos nas placas gradientes. Geralmente adicionamos 100 microliters na placa de 24 bem.
Coloque-os na incubadora à temperatura de 37 graus. Depois de 20 minutos, nós os colocamos para frente com a parte inferior na parte inferior e, em seguida, no meio. Com dois ou três dias de combate, geralmente vemos os organoides saírem.
Esta é a imagem típica de nossos organoides. Geralmente precisamos de células únicas de organoides se quisermos fazer a passagem ou fazer algum método de modificação genética Coletamos todos os organoides das placas de combate com o tampão de lavagem do casaco. Nós soltamos o supernatante, em seguida, no tampão de lavagem do casaco na placa, misture-os, então pep-lo para cima e para baixo.
E então nós geralmente pré-lavar todas as pontas com o buffer de fitas de lavagem. Para evitar que todos os organoides caiam nas pontas. E então, com um novo lote no gelo ou sem ele, coletamos todos os organoides por centro-fusão.
Nós os tratamos, há um radients conivente para remover todos os metrogels. Após 20 a 30 minutos de incubação no gelo todos os metrogel são removidos. Coletamos todos os organoides limpos e adicionamos trippsina para transformá-los em células únicas.
Depois que a trippsina é adicionada, tratamos os organoides na incubadora. Leva de 5 a 10 minutos para os organoides hepáticos se tornarem células únicas. Adicionamos mais tampões de lavagem para parar a triplatina.
E, em seguida, pep-lo para cima e para baixo em direção a eles. Para o processo de opção, você pode lavá-los mais uma vez para remover toda a trippsina. Depois de lavar por centrofusão, podemos contá-los sob o balcão de células.
Então vamos mostrar como fazer transação ou transfecção desses organoides hepatócitos. Primeiro, rotule os tubos do que você vai fazer, e então faremos a transfecção da visão de acordo com as instruções do fabricante. Você precisa.do regente do fato lipoyl domando INI MaX.
Nós adicionamos o. controlar e o gene específico siRNA, e incuba-los com o melhor, de acordo com as instruções do fabricante. E então, de acordo com a concentração celular, adicionamos o RAN max e os misturamos bem.
Em seguida, também adicionamos o RAN max com o ideal separadamente e colocá-los no gelo. Após 5 minutos, nós criamos a mistura ran max separada com diferentes siRNAs, gene ESPECÍFICO RANi e II controle separadamente e misturamos-os completamente. Coloque-os no gelo novamente, e então coletamos todos os organoides, centrofusão lenta, largamos todo o supernatante, adicionamos o RNAi max, a mistura de siRNA nesta placa celular e o arrastamos para cima e para baixo completamente.
Resumidamente, as células e o rótulo RNAi max e siRNA misturam foram gentrificação e incubam por 4 a 5 horas a 37 graus. Parte final, esses organoides hepatócitos também podem ser infectados pelo vírus Lenti. A mensagem semelhante foi realizada como transfecção do siRNA.
O controle e os tubos do vírus siRNA estavam bem preparados, e o ideal foi adicionado de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, com as regiões de infecção como poli verde e, em seguida, adicionamos diferentes vírus Lenti, de acordo com a constituição de instruções do fabricante. Combine as suspensões de células únicas na cultura organoides e várias partículas nos tubos eppendorf de 1,5 mililitros, Adicione, bem, misture-os Emplacando esta mistura, e concentre-os por 1 hora a 32 graus.
A fusão do concentrado será realizada a 500 G.E após 4 a 5 horas de incubação a 37 graus a suspensão da célula será então coletada e sentada em metrogel. E colocá-los na incubadora novamente. O órgão sobre a eficiência de formação ou outra análise funcional poderia ser realizado de 7 a 10 dias depois.
Aqui estão nossos resultados representativos. Na figura 1A, você pode ver nosso ALB-Cre Rosa 26-GFP ou RFP hepatócitos organoide de camundongo. Na figura 1B você pode ver o sinal positivo ki67 na coloração, que mostrou que nossos organoides hepatócitos estão proliferando.
Na figura 2A e 2B aqui está uma expressão genética representativa de nossa expressão interferente de nossos genes. Após a manipulação genética em organoides hepatócitos, o eficaz de interferência é muito eficiente. Aqui está a figura 2C, você pode ver depois da manipulação genética com a tecnologia carsonita em nossos organoides murinas.
Conclusão, nossos resultados mostraram que os organoides hepatócitos poderiam ser expandidos in vitro e geneticamente manipulados. Em resumo, neste vídeo mostramos como fazer a perfusão e digestão hepática para obter os hepatócitos. Como capturar os hepatócitos e passagem dos hepatócitos organoides.
Além disso, mostramos como fazer a infecção pelo siRNA e transfecção vetorial ou pela infecção pelo vírus Lenti para fazer a modificação da genética desses organoides. Além disso, temos duas escassez em nossos organoides. Primeiro, não usamos por núcleo ou núcleo de pele para puro os hepatócitos.
E segundo, acho que mais fatores de crescimento e sinalização devem ser tentados para melhorar o tempo de crescimento dos organoides.
