Nosso protocolo fornece um método rápido, reprodutível e confiável para gerar monocamadas epiteliais primárias diretas em diferentes superfícies com detritos mínimos. As principais vantagens deste protocolo são o baixo consumo de mídia e a manutenção de baixo custo da cultura celular. É um método rápido para realizar testes funcionais e aplicações rápidas a jusante.
Este protocolo fornecerá insights no estudo da reparação de feridas, barreira de permeabilidade e migração transepitelial de diferentes tipos de células. Além disso, este modelo pode ser útil na interação hospedeiro-patógeno, epitelial danificada e descoberta de drogas. Para começar, adicione 200 microliters de solução de revestimento a cada poço de uma placa de 48 poços e slide de câmara.
Pré-incubar ambos em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% a 37 graus Celsius por duas horas. Revestimento de 0,4 inserções de membrana celular de micrômetro com 200 microliters de solução de colágeno. Incubar a placa com as pastilhas de membrana a quatro graus Celsius por 30 minutos e, em seguida, transfira-a para uma incubadora de dióxido de carbono de 5% a 37 graus Celsius por duas horas.
Desinfetar um rato eutanizado com 70% de etanol, em seguida, dissecar o cólon do reto para o ceco com a ajuda de tesouras e fórceps. Limpe suavemente as fezes com PBS gelado em uma seringa de 10 mililitros equipada com um tubo de alimentação de calibre 20. Remova o cólon proximal e deslize o cólon distal suavemente para o tubo de alimentação de 20 medidores.
Amarre o cólon no final do tubo com rosca de seda 4-0. Inverta o cólon do avesso sobre a extremidade amarrada e amarre a outra extremidade com rosca, em seguida, corte o cólon abaixo da ponta do tubo de alimentação usando uma tesoura cirúrgica. Abra suavemente a extremidade desamaste do cólon invertido na ponta de uma seringa repetida de 1,25 mililitro usando seu êmbolo.
Deslize a extremidade desamascada do cólon invertido sobre a seringa e amarre-a firmemente com um fio. Insira o êmbolo na seringa e infle o cólon até parecer turgente sem rugas visíveis. Coloque a linguiça de cólon inflada em um tubo de 15 mililitros contendo cinco mililitros de solução de recuperação celular no gelo por 20 minutos.
Infle e esvazie o cólon uma vez a cada cinco minutos. Amarre o cólon inflado abaixo da ponta da seringa repetida usando rosca de sutura de seda 4-0. Corte a linguiça de cólon da seringa repetida e coloque-a em um tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de 50 mililitros EDTA por 40 minutos.
Gire o tubo a 4 graus Celsius. Substitua a solução EDTA por cinco mililitros de tampão de shake e agite a salsicha manualmente na posição vertical por dois minutos. Decante a solução de agitação em um novo tubo de 15 mililitros e repita o passo de agitação até que um total de 10 mililitros de criptas e tampão de agitação seja coletado.
Conte o número de criptas em 20 microlitros da suspensão sob um microscópio e dilua a amostra para obter a concentração de cinco criptas por microliter. Centrifugar a amostra de cripta a 400 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Enquanto isso, remova as pastilhas de placa e membrana de 48 poços da incubadora e coloque-a no armário de biossegurança.
Aspire a solução de revestimento usando uma pipeta P200 e deixe a placa com a tampa ligeiramente compensada até que as células estejam prontas para serem banhadas. Após a centrifugação da suspensão da cripta, remova o buffer de agitação e resuspenda a pelota intacta em três mililitros de mídia completa LWRN. Adicione 200 microliters de criptas a cada poço da placa pré-revestida de 48 poços e slide de câmara e incubar ambos em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% a 37 graus Celsius.
No dia seguinte, aspire a mídia e adicione novas mídias. Geralmente, as células se tornam confluentes em 24 a 48 horas. Para as pastilhas de membrana de cultura celular, adicione 200 microliters de criptas ao topo das pastilhas e 600 microliters de mídia LWRN completa à parte inferior.
No dia seguinte, aspire a mídia e adicione mídia fresca apenas à câmara superior. Incubar a placa em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% a 37 graus Celsius. Meça a resistência elétrica transepitelial todos os dias usando um medidor de volt/ohm epitelial.
Após isolar as criptas de um cólon murino e verificar a concentração, a suspensão da cripta foi concentrada em cinco criptas por microliter. Poços de placas de 48 poços foram submetidos a um ensaio de ferida de arranhão ao atingir a confluência celular. Após 24 horas, observou-se reparo da ferida indicando que a cultura era saudável e viável.
Valores de nível mais elevados foram alcançados quando a mídia foi alterada de LWRN para mídia de diferenciação. Além disso, observou-se uma diminuição dos marcadores ISC e um aumento nos marcadores de diferenciação indicando que as monocamadas diferenciadas foram geradas com sucesso. Além disso, o aparecimento de subtipos de células epiteliais diferenciadas cultivadas em diferentes condições foi demonstrada pela imunofluorescência.
Ao tentar este protocolo, é importante garantir que o cólon não seja rompido em nenhum momento durante a preparação e permaneça inflado para liberar criptas em preparação extremamente limpa. Uma vez que as monocamadas de células epiteliais intestinais 2d se formam, podemos realizar ensaios de imunofluorescência, ferida de arranhão e permeabilidade e outras aplicações a jusante. Isso fornecerá conhecimento em cicatrização de feridas, migração de diferentes tipos de células e estudos de reparação epitelial e danos.
