Para revestir a placa com EME, dilua EME 1 a 20 em DMEM Avançado frio+Para revestimento com colágeno, dilua cinco miligramas por mililitro de colágeno I em DMEM Avançado + para 100 microgramas por mililitro. Revestir com a placa com 200 microlitros de EME diluído ou colágeno para cobrir totalmente a superfície do poço e incubar por uma a duas horas a 37 graus Celsius. Para gerar monocamadas, aspirar o meio de uma placa de 35 milímetros contendo organoides.
Adicione um mililitro de PBS e interrompa o EME nos poços com uma ponta P1000, pipetando para cima e para baixo aproximadamente 20 vezes para soltar todo o EME. Transfira o conteúdo para um tubo cônico de 15 mililitros. Adicione um mililitro de PBS à placa para coletar organoides adicionais e transferi-los para o mesmo tubo cônico.
Centrifugar a amostra a 350 G durante dois minutos e remover o sobrenadante, incluindo qualquer resíduo de EME. Em seguida, adicione um mililitro de solução de tripsina ao pellet organoide e incube a 37 graus Celsius por dois minutos. Pipetar para cima e para baixo 10 vezes usando uma ponta P1000 e adicionar dois mililitros de DMEM+ avançado para neutralizar a tripsina.
Centrifugar a 350 G por cinco minutos e aspirar o supernante antes de ressuspender o pellet em 4,8 mililitros de rIOM2D. Remova o excesso de EME ou colágeno em Advanced DMEM+ dos poços. Em seguida, adicione 200 microlitros de organoides em rIOM2D e 10 micromolares Y27632 a cada poço pré-revestido.
Após 4 a 16 horas, recolher o meio e centrifugar a 1.000 G durante um minuto. Transfira o sobrenadante para um novo tubo cônico de 15 mililitros e descarte o pellet. Lave cada poço com 300 microlitros de PBS antes de adicionar 200 microlitros do rIOM2D centrifugado a cada poço.
Troque o rIOM2D a cada dois ou três dias, suspendendo o uso de monocamadas Y27632.2D banhadas no EME prontamente reformadas em pequenos esferoides quando o EME foi adicionado de volta ao topo das células. Em contraste, um substrato de colágeno I foi insuficiente para reformar estruturas 3D.
