Para começar, administrar analgesia por via subcutânea ao rato anestesiado que foi previamente injetado intracerebroventricularmente com o coquetel de liberação. Monte o rato na estrutura estereotáxica. Fixe a cabeça usando barras auriculares, garantindo que o movimento rotacional em direção à frente e para trás não seja obstruído.
Estabilize a cabeça para baixo em um ângulo de 40 graus para estender adequadamente a parte de trás do pescoço. Faça a barba do pescoço usando uma navalha e desinfete a pele com três rodadas alternadas de iodo a 10% de povidona e álcool usando cotonetes estéreis, esfregando em direções diferentes por três a cinco segundos cada vez. Com a ponta do dedo, identifique a área depressível em forma redonda entre a protuberância occipital e a coluna vertebral do atlas.
Marque este ponto usando um marcador. Fixe uma seringa de um mililitro na estrutura estereotáxica. Posicione a agulha para entrar em contato com a pele na marca.
Usando pinças, levante a pele enquanto insere a seringa através das camadas de pele. Puxe o êmbolo suavemente para criar pressão negativa no interior da seringa. Introduza gradualmente a agulha até que o líquido cefalorraquidiano seja visível na seringa.
Mantenha a agulha firme nesta posição e permita o fluxo lento do líquido cefalorraquidiano. Remova lentamente o líquido cefalorraquidiano até 120 microlitros. Recupere cuidadosamente a seringa.
Administrar um mililitro de soro normal por via intraperitoneal para apoiar a reposição hídrica do animal experimental. Combinar a biópsia líquida com 400 microlitros de meio de células-tronco neurais e armazenar o tubo de microcentrífuga a quatro graus Celsius para uso posterior. Em seguida, transfira o animal para a área de monitoramento pós-operação.
As biópsias de ordenha resultaram em culturas de células-tronco neurais com potencial médio de 3,17 passagens, chegando a nove passagens. As células coletadas foram plaqueadas em poços revestidos de Poli-D-lisina, onde cresceram como monocamadas aderentes e, mais raramente, como neuroesferas. As células recém-isoladas positivas para GFAP também foram imunopositivas para o marcador quiescente ID3 e apresentaram a característica morfológica bipolar do NSE.
A comparação imunocitoquímica de células derivadas de biópsia e post-mortem mostrou que o perfil das células coletadas foi semelhante ao das células endógenas da zona subependimária. O fator de crescimento resultou em um aumento concomitante e significativo de células SOX2 e na diminuição de neuroblastos duplo-cortin-positivos em ambas as amostras.
