Antes de mergulhar congelando as grades de microscopia eletrônica contendo as células, inspecione as grades sob um microscópio óptico invertido. Registre as densidades de células em cada grade para ajustar os tempos de mancha durante o congelamento de imersão. Aqueça dois a três mililitros de solução salina tamponada com fosfato ou PBS em uma placa vazia a 37 graus Celsius.
Para a preparação de fiduciais de ouro, pipete 50 microlitros de solução de esferas de ouro coloidal de 10 nanômetros em um tubo limpo de 1,5 mililitro. Adicionar dois microlitros de albumina de soro bovino e homogeneizar por micropipetagem repetidamente. Centrifugar o tubo a 15.000 a 20.000 G durante 15 minutos.
Retire cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet usando uma micropipeta. Ressuspender o pellet em 50 microlitros de PBS e centrifugar o tubo novamente, como demonstrado anteriormente. Aspirar quatro microlitros do pellet usando uma ponta de 10 microlitros e transferi-lo para um tubo limpo de 1,5 mililitro.
Montar a câmara ambiental a 95% de umidade e 30 graus Celsius. Usando cinco por 15 pinças, selecione uma grade e lave-a com PBS. Transfira a grade lavada para uma pinça mergulhadora.
Uma vez que a grade esteja presa, remova a pinça cinco por 15 e deslize a pinça na pinça mergulhadora. Insira a grade no congelador de imersão, mantendo a braçadeira segura. Adicione um microlitro de fiduciais de ouro à parte de trás da grade.
Em seguida, adicione dois a três microlitros de PBS ao lado de carbono da grade. Utilize o blotting automatizado para manchar a parte traseira da grade antes de mergulhar o congelamento em etano líquido. Uma imagem de microscopia eletrônica e de luz correlativa criocorrelativa de células U2OS transfectadas revelou a presença de células produtoras de HIV.
Uma imagem de criotomografia eletrônica mostrou múltiplas partículas de HIV brotando da membrana plasmática de células U2OS.
