Comece preparando o meio de cultura endotelial completo usando 460 mililitros de meio de célula endotelial e adicionando a ele, 50 mililitros de FBS, cinco mililitros de penicilina estreptomicina e cinco mililitros de suplemento de crescimento de células endoteliais. O meio preparado pode ser armazenado a quatro graus Celsius por um mês. Em seguida, em uma placa de cultura de tecidos de 100 milímetros contendo 0,1 milhão de células vasculares a oito mililitros do meio de cultura endotelial completo preparado e cultura das células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até que 70% de cofluência seja alcançada.
Em seguida, retire o meio de cultura da placa e lave as células duas vezes com PBS para eliminar células soltas e detritos. Após a remoção do PBS, adicionar três mililitros de tripsina a 0,25%, contendo 2,21 milimolares de EDTA às células e incubar a placa a 37 graus Celsius por um minuto. Verifique o descolamento celular em microscópio de luz com aumento de 40 vezes.
Neutralizar a tripsina com sete mililitros de meio de cultura endotelial completo e enxaguar suavemente as células da placa de cultura. Centrifugar a suspensão celular após coletá-la em um tubo de 15 mililitros a 400G por 10 minutos. Ressuspender as células em cinco mililitros de meio de cultura endotelial completo após a remoção do sobrenadante, contar as células usando um hemocitômetro e transferir um volume calculado de suspensão contendo 2 milhões de células para um tubo estéril de 1,5 mililitro.
Pastilhar as células centrifugando a suspensão a 400G por cinco minutos antes de remover o sobrenadante. As células vasculares estão agora prontas para a mistura com o gel de matriz para o ensaio do plugue de gel de matriz.
