Este trabalho foi financiado pela Fundação de Ciências Naturais da Província de Zhejiang (LY22H020005) e pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81873466).

Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Wenzhou Medical University (XMSQ2021-0057, 19 de julho de 2021). Todos os reagentes e consumíveis estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparo do meio de cultura
<ol><li>Meio de cultura 10x M199: Dissolver o pó M199 na concentração de 10x com 90 mL de água deionizada e adicionar 10 mL de soro fetal bovino (SFB), passando em seguida por um filtro de 0,22 μm. Conservar o meio a 4 °C até 2 meses.</li>
	<li>Meio de cultura endotelial completo: Adicionar 50 mL de SFB, 5 mL de penicilina/estreptomicina e 5 mL de suplemento de crescimento de células endoteliais a 460 mL de meio de células endoteliais (MEC). Conservar o meio a 4 °C durante um período máximo de 1 mês.</li>
</ol>2. Preparo celular vascular
<ol><li>Cultura 1 x 105 células vasculares (células progenitoras endoteliais primárias14, células endoteliais ou linhagens de células endoteliais) com 8 mL de meio de cultura endotelial completo em placa de cultura de tecido de 100 mm a 37 °C e 5% de CO2 a 70% de confluência.</li>
	<li>Retire o meio de cultura e lave a placa 2x com 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover células e detritos não aderidos. Retirar o PBS e adicionar 3 mL de tripsina a 0,25% contendo EDTA 2,21 mM e incubar a 37 °C por 1 min.</li>
	<li>Neutralizar a tripsina com 7 mL de meio de cultura endotelial completo e enxaguar suavemente as células da placa de cultura. Confirmar o descolamento celular ao microscópio de luz (aumento de 40x).</li>
	<li>Recolher a suspensão celular num tubo de 15 ml e centrifugar a 400 x g durante 10 min. Remover o sobrenadante e ressuspender as células com 5 mL de meio de cultura endotelial completo.</li>
	<li>Contar células usando um hemocitômetro e mover a suspensão contendo 2 x 106 células para um tubo estéril de 1,5 mL. Cada plugue contém 1,5 x 106 células, 25% adicionais são usadas células em caso de resíduos. Cada grupo inclui pelo menos 3 plugues. NOTA: Após ensaios, verificou-se que 1,5 x 106 células em 300 μL de gel de matriz levou ao desenvolvimento adequado da angiogênese e, portanto, foi escolhido para experimentação.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão de células a 400 x g por 5 min para células de pellet e, em seguida, remover o sobrenadante.</li>
</ol>3. Preparação do gel da matriz
<ol><li>Pré-resfriar tubos estéreis de 1,5 mL contendo pellet de células em banho-maria a 4 °C. Pré-resfriar seringas de insulina de 30G 1 mL em geladeira a 4 °C.</li>
	<li>Descongelar completamente o gel de matriz em banho-maria a 4 °C. Não misture ou vórtice. Pré-resfriar 10x M199 e testar reagente/droga de interesse em banho-maria a 4 °C.</li>
	<li>Misturar o gel de matriz pré-resfriado com 10x M199 contendo 10% de FBS e o reagente a ser testado na proporção de volume de 8,8:1:0,2 para obter um gel de matriz e uma mistura M199 contendo 1% de FBS e o reagente.</li>
	<li>Ressuspenda as células com 400 μL da mistura de gel de matriz, misture suavemente para evitar a formação de bolhas. Mantenha o tubo no gelo até que os ratos estejam preparados para a injeção. Mantenha a mistura de gel de matriz no gelo o tempo todo para evitar coagulação. NOTA: Aqui, 300 μL de mistura de gel de matriz contendo 1,5 x 106 células foram usados para formar plugue de gel. Prepare 25% de gel extra de acordo com 25% de células adicionais na etapa 2.</li>
</ol>4. Preparação do rato
<ol><li>Anestesiar camundongos Nu/Nu machos de 6-8 semanas de idade (18-25 g) na câmara do dispositivo de anestesia animal com isoflurano (isoflurano a 3% em oxigênio a 100% a uma taxa de fluxo de 1 L/min). Após anestesia bem-sucedida, confirmada pela ausência de reflexo de retificação e reflexo de pinça dos dedos, mova o camundongo para fora da câmara, mova o mouse para fora da câmara e coloque uma máscara de anestesia no camundongo e altere a concentração de isoflurano para 1,5% em oxigênio a 100% a uma taxa de fluxo de 1 L/min. OBS: Fornecer suporte térmico ao animal utilizando uma almofada de aquecimento durante todo o procedimento.</li>
	<li>Use pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento. Tape os membros dos ratos na placa de operação na posição prona.</li>
</ol>5. Injeção de mistura de gel de matriz
<ol><li>Carregar 300 μL da mistura de gel de matriz em uma seringa de insulina de 1 mL com uma agulha 30G. Evite a formação de bolhas. Carregue rapidamente o gel de matriz (dentro de 2 min) para evitar a solidificação durante este tempo. Coloque imediatamente a seringa de insulina carregada com gel de matriz no gelo.</li>
	<li>Limpe a pele nas costas dos ratos usando almofadas de álcool a 75%. Injetar por via subcutânea 300 μL de mistura de gel de matriz em um lado do dorso de camundongos.</li>
	<li>Retire suavemente a agulha do local de injeção para evitar a fuga da mistura de gel de matriz. Verifique se há uma pequena corcova no local da injeção (Figura 1).</li>
	<li>Coloque o mouse na almofada de aquecimento por 2 min para deixar a mistura de gel de matriz coagular e formar plug.</li>
	<li>Repita as etapas 5.2. ao ponto 5.4. para criar plugue no outro lado da parte de trás do mouse. Marque as bordas das corcovas usando uma caneta marcadora.</li>
	<li>Observe o camundongo até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Coloque o rato numa gaiola separada até que esteja totalmente recuperado. Alojar os camundongos em laboratório experimental de animais da classe SPF a 22 ± 2 °C com um ciclo claro/escuro de 12 h por 7 dias.</li>
</ol>6. Injeção de Dextran-FITC através da veia caudal
<ol><li>Após 7 dias da injeção do gel de matriz, ressuspender 0,5 mg de dextran-FITC com 500 μL de água bidestilada (ddH2O) e, em seguida, vórtice violento para obter a solução de dextran-FITC na concentração final de 1 μg/μL. NOTA: Use dextran-FITC com peso molecular de ~150 kDa para o ensaio de angiogênese, e use dextran-FITC com peso molecular de ~4 kDa para o ensaio de permeabilidade vascular.</li>
	<li>Carregar 50 μL de solução de dextran-FITC nas seringas de 29G.</li>
	<li>Fixe o mouse no instrumento de injeção da veia da cauda. Limpe a cauda com algodão com álcool 75% e injete suavemente 50 μL de dextran-FITC através da veia da cauda.</li>
	<li>Comprimir o local de injeção com cotonete por 1 min para estancar o sangramento e, em seguida, colocar os camundongos de volta na gaiola por 30 minutos.</li>
	<li>Repita as etapas 6.3. e 6.4. até que todos os camundongos tenham recebido injeção de dextran-FITC.</li>
</ol>7. Coleta do plugue de gel Matrix
<ol><li>Injetar por via intraperitoneal pentobarbital sódico a 1% em PBS (200 mg/kg de peso corporal) e eutanasiar os camundongos com um procedimento aprovado pela IACUC.</li>
	<li>Corte a pele ao longo da borda marcada do plugue usando tesoura cirúrgica e remova a pele acima do plugue de gel de matriz.</li>
	<li>Recolher o tampão e enxaguar num copo pequeno com 1x PBS para lavar o excesso de sangue (Figura 2A). A cor do tampão pode delinear grosseiramente o grau de abundância sanguínea e o conteúdo dos neovasos (Figura 3A).</li>
</ol>8. Incorporação de plugue de gel de matriz e preparação de seção
<ol><li>Cubra o botão do de incorporação de tecido com cerca de 0,5 mL de gel de incorporação de tecido e, em seguida, coloque imediatamente o plugue de gel de matriz no gel de incorporação de tecido na orientação desejada, conforme mostrado na Figura 2B. Em seguida, incorpore o plugue com gel de incorporação de tecido adicional.</li>
	<li>Coloque os em um freezer de -80 °C por 12 h para solidificar.</li>
	<li>Para a preparação de seções espessas, retire o bloco de plugue solidificado e corte seções de 12 μm de espessura usando o micrótomo de congelamento de acordo com a instrução e monte em lâminas de microscópio.</li>
	<li>Corte de 5 a 10 seções de cada bloco de plugue.</li>
</ol>9. Quantificação da angiogênese (Figura 3)
<ol><li>Adquira imagens de fluorescência de 5 campos independentes da seção com um microscópio de fluorescência invertida no comprimento de onda de 488 nm sob aumento de 10x.</li>
	<li>Abra o arquivo de imagem com o software Image J (https://imagej.en.softonic.com/) e clique no botão Angiogenesis Analyze . Em seguida, clique no botão Analisar contraste de fase do HUVEC e alterne para Tabela de resultados do stat para coletar informações. Meça todas as 5 imagens de fluorescência adquiridas para cada seção.</li>
	<li>Analisar o comprimento total dos neovasos dos diferentes grupos para avaliar estatisticamente a diferença na angiogênese entre esses grupos. NOTA: O comprimento total dos segmentos mestre indica o comprimento total dos neo-vasos. O reagente que aumenta o comprimento dos neovasos é denominado pró-angiogênico, enquanto o reagente que diminui o comprimento dos neovasos é antiangiogênico.</li>
</ol>10. Quantificação da permeabilidade vascular (Figura 4)
<ol><li>Adquira imagens de fluorescência de 5 campos independentes da seção com um microscópio de fluorescência invertida no comprimento de onda de 488 nm sob aumento de 20x.</li>
	<li>Abra o arquivo de imagem com o software Image J. Clique no botão Seleção à mão livre e circule a área de vazamento, clique no menu Analisar e selecione a opção Medir para obter as informações da área de vazamento. Use a razão entre a área de vazamento e a área de imagem para indicar a permeabilidade vascular.</li>
	<li>Analisar a relação entre a área de vazamento e a área da imagem dos diferentes grupos para avaliar estatisticamente a diferença de permeabilidade vascular entre esses grupos.</li>
</ol>

Simplificando os estudos de angiogênese com um ensaio de tampão de gel de matriz modificada

<ol>
	<li>Bikfalvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+and+conceptual+developments+in+vascular+biology+and+angiogenesis+research:+a+personal+view.">History and conceptual developments in vascular biology and angiogenesis research: a personal view.</a> Angiogenesis. 20 (4), 463-478 (2017).</li><li>Carmeliet, P., Jain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+mechanisms+of+vessel+normalization+for+cancer+and+other+angiogenic+diseases.">Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases.</a> Nature reviews Drug discovery. 10 (6), 417-427 (2011).</li><li>De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+tumour+angiogenesis.">Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis.</a> Nature reviews Cancer. 17 (8), 457-474 (2017).</li><li>Griffioen, A., Molema, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis:+potentials+for+pharmacologic+intervention+in+the+treatment+of+cancer,+cardiovascular+diseases,+and+chronic+inflammation.">Angiogenesis: potentials for pharmacologic intervention in the treatment of cancer, cardiovascular diseases, and chronic inflammation.</a> Pharmacological reviews. 52 (2), 237-268 (2000).</li><li>Viallard, C., Larriv&#233;e, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis+and+vascular+normalization:+alternative+therapeutic+targets.">Tumor angiogenesis and vascular normalization: alternative therapeutic targets.</a> Angiogenesis. 20 (4), 409-426 (2017).</li><li>Craig, M., Sumanas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ETS+transcription+factors+in+embryonic+vascular+development.">ETS transcription factors in embryonic vascular development.</a> Angiogenesis. 19 (3), 275-285 (2016).</li><li>Losordo, D., Dimmeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+angiogenesis+and+vasculogenesis+for+ischemic+disease.+Part+I:+angiogenic+cytokines.">Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease. Part I: angiogenic cytokines.</a> Circulation. 109 (21), 2487-2491 (2004).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-angiogenesis-new+concept+for+therapy+of+solid+tumors.">Anti-angiogenesis-new concept for therapy of solid tumors.</a> Annals of Surgery. 175 (3), 409-416 (1972).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+cancer,+vascular,+rheumatoid+and+other+disease.">Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease.</a> Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opinion+-+Angiogenesis:+an+organizing+principle+for+drug+discovery.">Opinion - Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 6 (4), 273-286 (2007).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).</li><li>Fan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1&#946;+augments+the+angiogenesis+of+endothelial+progenitor+cells+in+an+NF-&#954;B/CXCR7-dependent+manner.">Interleukin-1&#946; augments the angiogenesis of endothelial progenitor cells in an NF-&#954;B/CXCR7-dependent manner.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (10), 5605-5614 (2020).</li><li>Dai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+transcriptional+upregulation+of+IDH2+to+tune+mitochondrial+dynamics+and+rescue+angiogenic+function+of+diabetic+EPCs.">Nrf2 transcriptional upregulation of IDH2 to tune mitochondrial dynamics and rescue angiogenic function of diabetic EPCs.</a> Redox Biology. 56, 102449 (2022).</li><li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liraglutide+Improves+the+Angiogenic+Capability+of+EPC+and+Promotes+Ischemic+Angiogenesis+in+Mice+under+Diabetic+Conditions+through+an+Nrf2-Dependent+Mechanism.">Liraglutide Improves the Angiogenic Capability of EPC and Promotes Ischemic Angiogenesis in Mice under Diabetic Conditions through an Nrf2-Dependent Mechanism.</a> Cells. 11 (23), 3821 (2022).</li><li>Koh, W., Stratman, A., Sacharidou, A., Davis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+three+dimensional+collagen+matrix+models+of+endothelial+lumen+formation+during+vasculogenesis+and+angiogenesis.">In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis.</a> Methods in enzymology. 443, 83-101 (2008).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).</li><li>Malinda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+matrigel+migration+and+angiogenesis+assay.">In vivo matrigel migration and angiogenesis assay.</a> Methods in molecular biology (Clifton, NJ). , 287-294 (2009).</li><li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+ex+vivo+retina+angiogenesis+assays.">In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).</li><li>Dai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF21+promotes+ischaemic+angiogenesis+and+endothelial+progenitor+cells+function+under+diabetic+conditions+in+an+AMPK/NAD+-dependent+manner.">FGF21 promotes ischaemic angiogenesis and endothelial progenitor cells function under diabetic conditions in an AMPK/NAD+-dependent manner.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (6), 3091-3102 (2021).</li><li>Gavard, J., Gutkind, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+controls+endothelial-cell+permeability+by+promoting+the+beta-arrestin-dependent+endocytosis+of+VE-cadherin.">VEGF controls endothelial-cell permeability by promoting the beta-arrestin-dependent endocytosis of VE-cadherin.</a> Nature cell biology. 8 (11), 1223-1234 (2006).</li><li>Birdsey, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+transcription+factor+ERG+promotes+vascular+stability+and+growth+through+Wnt/&#946;-catenin+signaling.">The endothelial transcription factor ERG promotes vascular stability and growth through Wnt/&#946;-catenin signaling.</a> Developmental Cell. 32 (1), 82-96 (2015).</li><li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+CXCR4+antagonist+enhances+angiogenesis+via+modifying+the+ischaemic+tissue+environment.">A Novel CXCR4 antagonist enhances angiogenesis via modifying the ischaemic tissue environment.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (10), 2298-2307 (2017).</li></ol>

Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.

Apresentamos um método confiável e conveniente para a avaliação quantitativa da angiogênese in vivo sem coloração. Nesse protocolo, as células vasculares foram misturadas com gel de matriz na presença de reagentes pró-angiogênicos ou antiangiogênicos e, em seguida, injetadas por via subcutânea no dorso de camundongos Nu/Nu para formar plugue de gel (Figura 1). Após 7 dias da formação do plugue de gel, o dextran-FITC foi injetado por via intravenosa e circulado por 30...

A angiogênese, processo de formação de neovasos a partir de vasos pré-existentes, desempenha papel crítico em muitos processos fisiológicos e patológicos, como desenvolvimento embrionário, cicatrização de feridas, aterosclerose, desenvolvimento tumoral, etc.1,2,3,4,5. Esse processo dinâmico envolve várias etapas, incluindo a degradação da matriz, proliferação de células vasculares, migração e auto-organização para formar estruturas tubulares e a estabilização dos neovasos6. A promoção da angiogênese tem se mostrado fundamental no tratamento do infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral e outros tipos de doenças isquêmicas7, enquanto a inibição da angiogênese tem sido considerada uma estratégia promissora no tratamento decânceres8 e doenças reumatoides9. A angiogênese tem sido considerada um princípio organizador para a descoberta defármacos 10. Assim, a construção de um método confiável e conveniente para avaliar a extensão da angiogênese é fundamental para a pesquisa mecânica ou descoberta de drogas em doenças dependentes de angiogênese.
Vários modelos in vitro e in vivo têm sido desenvolvidos para avaliar a angiogênese11. Dentre estes, modelos bidimensionais (2-D), como o ensaio de formação de tubos de gel de matriz12, não podem formar estruturas tubulares funcionais. Os modelos animais, como o modelo de isquemia de membropélvico13,14, podem reproduzir o processo de angiogênese, mas são complexos e requerem um sistema de imagem de fluxo sanguíneo pontilhado a laser. Modelos 3D de morfogênese vascular, como o matrix gel plug assay, fornecem uma plataforma simples que pode mimetizar o processo de angiogênese invivo15, mas a detecção de angiogênese requer imunohistoquímica ou coloração de imunofluorescência16,17,18, que são variáveis e pouco visualizadas.
Aqui, descrevemos um protocolo para um ensaio de plugue de gel de matriz modificado onde células vasculares foram misturadas com gel de matriz e injetadas subcutaneamente no dorso de camundongos para formar um plug. No plug, as células vasculares precisam degradar a matriz, proliferar, migrar e se auto-organizar para finalmente formar vasos funcionais com fluxo sanguíneo no ambiente interno. Depois disso, o dextran fluorescente é injetado através da veia da cauda, para fluir através do plugue, e o rótulo é visualizado para indicar neo-vasos. O conteúdo da angiogênese pode ser avaliado quantitativamente pelo comprimento dos vasos. Esse método pode formar vasos funcionais que não podem ser produzidos em modelos de angiogênese2D12 e não necessita de processos complexos de coloração como no ensaio de plugue de gel de matrizcomum11. Também não requer instrumentos específicos de alto custo, como o laser speckle blood flow imaging system no modelo de isquemia de membro pélvico13,14,19. Este método é versátil, de baixo custo, quantificável e de fácil execução, podendo ser utilizado para determinar a capacidade pró ou antiangiogênica de fármacos ou ser utilizado em pesquisas mecânicas envolvidas na angiogênese.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>CITOTEST</td>
			<td>188105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia System</td>
			<td>RWD</td>
			<td>R640-S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoslicer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>CryoStar NX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrans-FITC-150kDa</td>
			<td>WEIHUA BIO</td>
			<td>WH007N07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrans-FITC-4kDa</td>
			<td>WEIHUA BIO</td>
			<td>WH007N0705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Cassettes</td>
			<td>CITOTEST</td>
			<td>80203-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Medium</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>35809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Growth Supplements</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10100147C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor 1</td>
			<td>AtaGenix</td>
			<td>9043p-082318-A01</td>
			<td>FGF1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ni</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad</td>
			<td>Boruida</td>
			<td>30-50-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>300841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>RWD</td>
			<td>R510-22-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory&#160;Balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>BSA124S-CW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356234</td>
			<td>Matrix gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199 powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31100-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound</td>
			<td>SUKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td>Tissue embedding gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitate Acid</td>
			<td>KunChuang</td>
			<td>KC001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Liquid</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Instruments</td>
			<td>RWD</td>
			<td>RWD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tail Vein Injection Instrument</td>
			<td>KEW BASIS</td>
			<td>KW-XXY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T1320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Temperature Freezer</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>U410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vascular Endothelial Growth Factor</td>
			<td>CHAMOT</td>
			<td>CM058-5HP</td>
			<td>VEGF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modified in vivo matrix gel plug assay for angiogenesis studies

Vários modelos têm sido desenvolvidos para investigar a angiogênese in vivo. No entanto, a maioria desses modelos é complexa e cara, requer equipamentos especializados ou é de difícil execução para posterior análise quantitativa. Apresentamos aqui um ensaio de plugue de gel de matriz modificado para avaliar a angiogênese in vivo. Nesse protocolo, as células vasculares foram misturadas com gel de matriz na presença ou ausência de reagentes pró-angiogênicos ou antiangiogênicos e, em seguida, injetadas por via subcutânea no dorso dos camundongos receptores. Após 7 dias, tampão fosfato salino contendo dextran-FITC é injetado através da veia caudal e circulado nos vasos por 30 min. Os plugues de gel de matriz são coletados e embebidos com gel de incorporação de tecido, em seguida, cortes de 12 μm são cortados para detecção de fluorescência sem coloração. Neste ensaio, dextran-FITC com alto peso molecular (~150.000 Da) pode ser usado para indicar vasos funcionais para detectar seu comprimento, enquanto dextran-FITC com baixo peso molecular (~4.400 Da) pode ser usado para indicar a permeabilidade de neo-vasos. Em conclusão, este protocolo pode fornecer um método confiável e conveniente para o estudo quantitativo da angiogênese in vivo.

Angiogenesis, the process of formation of neo-vessels from pre-existing vessels, plays a critical role in many physiological and pathological processes, such as embryonic development, wound healing, atherosclerosis, tumor development, etc.1,2,3,4,5. This dynamic process involves several steps, including the degradation of the matrix, vascular cell proliferation, migration and self-organization to form tubular structures and the stabilization of the neo-vessels6. Promoting angiogenesis has been demonstrated to be critical in the treatment of myocardial infarction, stroke and other kinds of ischemic diseases7 while inhibiting angiogenesis has been considered a promising strategy in the treatment of cancers8 and rheumatoid diseases9. Angiogenesis has been considered an organizing principle for drug discovery10. Thus, the construction of a reliable and convenient method to assess the extent of angiogenesis is critical for mechanical research or drug discovery in angiogenesis-dependent diseases.
Several in vitro and in vivo models have been developed to evaluate angiogenesis11. Among these, two-dimensional (2-D) models, like matrix gel tube formation assay12, cannot form functional tubular structures. The animal models, such as the hind limb ischemia model13,14, can reproduce the angiogenesis process but are complex and require a laser speckle blood flow imaging system. 3D models of vascular morphogenesis, like matrix gel plug assay, provide a simple platform that can mimic the process of angiogenesis in vivo15, but the detection of angiogenesis requires immunohistochemistry or immunofluorescence staining16,17,18, which are variable and poorly visualized.
Here, we describe a protocol for a modified matrix gel plug assay where vascular cells were mixed with matrix gel and subcutaneously injected into the back of mice to form a plug. In the plug, vascular cells need to degrade the matrix, proliferate, migrate, and self-organize to finally form functional vessels with blood flow in the internal environment. Thereafter, fluorescent-labeled dextran is injected via the tail vein, to flow through the plug, and the label is visualized to indicate neo-vessels. The content of angiogenesis can be quantitatively evaluated by the length of the vessels. This method can form functional vessels that cannot be produced in 2-D angiogenesis models12, and does not need complex stain process as in ordinary matrix gel plug assay11. It also does not require expensive specific instruments like laser speckle blood flow imaging system in hind limb ischemia model13,14,19. This method is versatile, low-cost, quantifiable, and easy to perform, and can be used to determine the pro- or anti-angiogenic capability of drugs or be used in mechanical research involved in angiogenesis.

Autor em destaque: Investigando a angiogênese e a permeabilidade dos vasos por meio de um ensaio de tampão de gel de matriz modificada

Ensaio de plugue de gel de matriz in vivo modificado para estudos de angiogênese

Our research deals with angiogenesis, the process of formation of new vessels from preexisting vessels. It plays a critical role in many physiological and pathological processes, such as embryonic development or curing atherosclerosis, tumor development, etc. The construction of a reliable model to evaluate the extent of angiogenesis is critical for myocardial research or the discovery of medicines for angiogenesis-depend diseases.However, most of the existing models are complex, expensive, and require specialized equipment. Here, we present a modified matrix gel plug assay that can be used to investigate angiogenesis and vessel permeability without staining in a simple, more intuitive, as well as efficient manner.

A Figura 1 é o fluxograma descrevendo como preparar a mistura de gel de matriz, células vasculares, meio de cultura e reagente. A mistura foi então injetada por via subcutânea no dorso de camundongos Nu/Nu e aquecida usando uma almofada de aquecimento para acelerar sua coagulação e, finalmente, formar plugue de gel.
A Figura 2A é o fluxograma para indicar vasos com dextrano marcado fluorescente. O dextran fluorescente marcado f...

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O método aqui apresentado pode avaliar o efeito dos reagentes na angiogênese ou permeabilidade vascular in vivo sem coloração. O método utiliza injeção de dextran-FITC através da veia caudal para visualizar neovasos ou extravasamento vascular.

Several models have been developed to investigate angiogenesis in vivo. However, most of these models are complex and expensive, require specialized ...

Nossa pesquisa trata da angiogênese, o processo de formação de novos vasos a partir de vasos preexistentes. Desempenha um papel crítico em muitos processos fisiológicos e patológicos, tais como o desenvolvimento embrionário ou cura da aterosclerose, desenvolvimento de tumores, etc. A construção de um modelo confiável para avaliar a extensão da angiogênese é fundamental para a pesquisa miocárdica ou para a descoberta de medicamentos para doenças dependentes da angiogênese.No entanto, a maioria dos modelos existentes são complexos, caros e requerem equipamentos especializados. Apresentamos aqui um ensaio de plugue de gel de matriz modificado que pode ser usado para investigar angiogênese e permeabilidade do vaso sem coloração de forma simples, mais intuitiva e eficiente.

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Research

JoVE Journal

Biology

Modified In Vivo Matrix Gel Plug Assay for Angiogenesis Studies

549 visualizações.  Pingyang Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University. Nossa pesquisa trata da angiogênese, o processo de formação de novos vasos a partir de vasos preexistentes. Desempenha um papel crítico em muitos processos fisiológicos e patológicos, tais como o desenvolvimento embrionário ou cura da aterosclerose, desenvolvimento de tumores, etc. A construção de um modelo confiável para avaliar a extensão da angiogênese é fundamental para a pesquisa miocárdica ou para a descoberta de medicamentos para doenças dependentes da angiogênese.

Vídeo: Autor em destaque: Investigando a angiogênese e a permeabilidade dos vasos por meio de um ensaio de tampão de gel de matriz modificada

Several models have been developed to investigate angiogenesis in vivo. However, most of these models are complex and expensive, require specialized equipment, or are hard to perform for subsequent quantitative analysis. Here we present a modified matrix gel plug assay to evaluate angiogenesis in vivo. In this protocol, vascular cells were mixed with matrix gel in the presence or absence of pro-angiogenic or anti-angiogenic reagents, and then subcutaneously injected into the back of recipient mice. After 7 days, phosphate buffer saline containing dextran-FITC is injected via the tail vein and circulated in vessels for 30 min. Matrix gel plugs are collected and embedded with tissue embedding gel, then 12 &#181;m sections are cut for fluorescence detection without staining. In this assay, dextran-FITC with high molecular weight (~150,000 Da) can be used to indicate functional vessels for detecting their length, while dextran-FITC with low molecular weight (~4,400 Da) can be used to indicate the permeability of neo-vessels. In conclusion, this protocol can provide a reliable and convenient method for the quantitative study of angiogenesis in vivo.

The method presented here can evaluate the effect of reagents on angiogenesis or vascular permeability in vivo without staining. The method uses dextran-FITC injection via the tail vein to visualize neo-vessels or vascular leakage.

Biologia

Preparing Vascular Cells for In Vivo Matrix Gel Plug Assay

Begin by preparing the complete endothelial culture medium using 460 milliliters of endothelial cell medium, and adding into it, 50 milliliters of FBS, five milliliters of penicillin streptomycin, and five milliliters of endothelial cell growth supplement. The prepared media can be stored at four degrees celsius for a month. Next, in a 100 millimeter tissue culture dish containing 0.1 million vascular cells at eight milliliters of the prepared complete endothelial culture medium and culture the cells at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide until 70%co-fluency is achieved.Then, remove the culture medium from the dish and rinse the cells twice with PBS to eliminate unattached cells and debris. After removing the PBS, add three milliliters of 0.25%trypsin, containing 2.21 millimolar EDTA to the cells and incubate the dish at 37 degrees Celsius for one minute. Verify cell detachment under a light microscope at 40 times magnification.Neutralize the trypsin with seven milliliters of complete endothelial culture medium and gently rinse the cells off the culture dish. Centrifuge the cell suspension after collecting it in a 15 milliliter tube at 400G for 10 minutes. Re-suspend the cells in five milliliters of complete endothelial culture medium after removing the supernatant, then count the cells using a hemo-cytometer, and transfer a calculated volume of suspension containing 2 million cells to a sterile 1.5 milliliter tube.Pellet the cells by centrifuging the suspension at 400G for five minutes before removing the supernatant. The vascular cells are now ready for mixing with the matrix gel for matrix gel plug assay.

Preparando células vasculares para ensaio de plugue de gel de matriz in vivo

Preparing Matrix Gel with Vascular Cells for In Vivo Matrix Gel Plug Assay

To begin, prepare 10 times M199 culture medium by dissolving M199 powder to 10 times concentration in 90 milliliters of deionized water, followed by the addition of 10 milliliters of FBS. Filter the solution through a 0.22 micron filter. The filtered medium can be stored at four degrees Celsius for up to two months.For preparing the matrix gel with vascular cells, use about 2 million vascular cells. Cool the sterile 1.5 milliliter tube containing the appropriately prepared cell pellet in an ice bath. Thaw the matrix gel completely in an ice bath without mixing or vortexing it.Similarly, cool the prepared 10 times M199 culture media along with the test reagent or drug of interest to four degrees Celsius. Next, maintaining a volume ratio of 8.8 to 1 to 0.2, combine the pre-cooled matrix gel with the pre-cooled 10 times M199 media containing 10%FBS, and the pre-cooled test reagent to produce the matrix gel mixture. Finally, re-suspend the pre-cooled cells in 400 microliters of the prepared matrix gel mixture by mixing gently to avoid forming bubbles.Keep the tube containing the cells in matrix gel on ice until the mice are ready for the matrix gel injection.

Preparando Matrix Gel com Células Vasculares para Ensaio In Vivo Matrix Gel Plug

Matrix Gel Mixture Injection into Mouse for Matrix Gel Plug Assay

To begin, place the 30 gauge one milliliter insulin syringes in a four degrees Celsius refrigerator for cooling. Keep the freshly prepared matrix gel mix containing vascular cells on ice until the mouse is ready for the injection. Next, place the properly anesthetized mouse on the operating board in a prone position and secure its limbs onto the board using tape.Load a pre cooled insulin syringe with 300 microliters of the matrix gel mixture, avoiding the formation of bubbles. Disinfect the skin on the back of the mouse using 75%alcohol pads, then subcutaneously inject 300 microliters of the matrix gel mixture in the syringe into one side of the animal's back. Gently remove the needle from the injection site to prevent any leakage of the gel mixture.Ensure the formation of a small hump at the injection site. Position the mouse on a heating pad for two minutes to allow the matrix gel mixture to coagulate and form a plug. Repeat the demonstrated steps to create a plug on the other side of the mouse's back.Mark the edges of the hump using a marker pen. House the animal in a specific pathogen free experimental animal laboratory at 20 to 24 degrees with 12 hour light and 12 hour dark cycles for seven days.

Injeção de mistura de gel de matriz em mouse para ensaio de plugue de gel de matriz

Dextran-FITC Injection and Matrix Gel Plug Collection from Mouse for Matrix Gel Plug Assay

To inject the mouse with Dextran, FITC seven days post the matrix gel injection, RESUSPEND 0.5 milligrams of Dextran, FITC in 500 microliters of double distilled water. Thoroughly vortex it to obtain a one microgram per microliter Dextran, FITC solution. Fill a 29 gauge syringe with 50 microliters of the Dextran FITC solution.Secure the mouse on the tail vein injection instrument, sanitize the tail with a 75%alcohol soaked cotton ball before carefully injecting 50 microliters of the Dextran FITC solution in the syringe into the tail vein. Apply pressure to the injection site with the cotton swab for one minute to staunch bleeding. Return the mouse to its cage and let it relax for 30 minutes before collecting the matrix gel plug.To collect the gel plug, cut the skin of the euthanized mouse along the marked border of the plug, using surgical scissors. And remove the skin above the matrix gel plug. Collect the plug and rinse it in a beaker with phosphate buffered saline to wash off any excess blood.Next, cover the bottom of the tissue embedding cassette with about 0.5 milliliters of tissue embedding gel. Then swiftly place the matrix gel plug on the tissue embedding gel in the planned orientation. Embed the plug with additional tissue embedding gel.Solidify the cassettes at minus 80 degrees Celsius for 12 hours. After removing the solidified plug block, cut 12 micron thick sections using a freezing microtome. Then mount the sections onto microscope slides.