Comece incorporando o tecido pulmonar e a agarose e seccionando-o usando um vibratome. Aos tecidos fatiados, adicione 300 microlitros do bloqueador. Incubar a placa a quatro graus Celsius em um agitador com agitação suave por 45 minutos.
Em seguida, pipetar 300 microlitros do PBS diluiu o anticorpo primário em cada poço. Incube a placa durante a noite a quatro graus Celsius com agitação suave. Agora, pipete suavemente os anticorpos primários sem tocar na fatia.
Lave as fatias três vezes com 400 microlitros de PBS. Em seguida, pipetar 300 microlitros dos anticorpos secundários diluídos em cada poço. Remover a solução de anticorpos após incubação a frio por 90 minutos.
Em seguida, adicione o DAPI e a lectina de tomate 488 aos poços. Incubar a mistura por 30 minutos. Após a remoção do DAPI e da lectina de tomate, lave as fatias em PBS por três ciclos de 10 minutos.
Com um pincel, transfira as fatias para um slide. Coloque três gotas de meio de montagem sobre o slide e monte um deslizamento de tampa sobre ele antes de fazer a imagem. As seções pulmonares de amostras de camundongos, suínos e humanos foram coradas por imunofluorescência para AME, elastina e LEA.
Observou-se que a AMS e a elastina estavam distribuídas em estruturas como ductos alveolares, vasos sanguíneos, bronquíolos e alvéolos. Foi realizada comparação da distribuição dos pneumócitos tipo II em humanos adultos e lactentes. O anticorpo de células alveolares tipo II HT2-280 apresentou forte afinidade pela superfície celular dos pneumócitos.
A amostra de lactentes apresentou contagem de pneumócitos tipo II significativamente maior. No entanto, a amostra infantil também apresentou cobertura de andaime significativamente maior do que a adulta. O número de pneumócitos tipo II com base na cobertura de andaimes também foi significativamente maior nos lactentes.
