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SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - TDE (SHORT) Tissue Transformation Technique

Transcrição

Comece colocando as seções cerebrais fixadas em formalina e embutidas em parafina em pratos com tampas de parafuso. Fixe a solução de desligamento aos pratos, cubra-os com papel alumínio e incube a quatro graus Celsius enquanto agita por um dia. No dia seguinte, transfira todas as amostras para novos pratos e incube-as com a solução de ligação, como mostrado anteriormente.

Ao final da incubação, coloque as amostras em tubos e lave-as três vezes com PBS por duas horas enquanto agita. Em seguida, adicione solução de inativação às amostras e incube durante a noite em banho-maria a 37 graus Celsius. Depois de realizar três lavagens, adicione solução de limpeza às amostras e incube em banho-maria de 55 graus Celsius por três a sete dias.

Ao final da incubação, lavar as amostras com PBST a 37 graus Celsius por três horas em uma incubadora. No dia seguinte, adicione 10 mililitros de peróxido de hidrogênio a 30% a cada amostra e lave as amostras três vezes com PBS por 10 minutos, agitando à temperatura ambiente. Em seguida, pré-aqueça a solução de recuperação de antígeno a 95 graus Celsius em banho-maria.

Transfira as amostras para a solução aquecida e incube a 95 graus Celsius durante 10 minutos, seguidos de 40 minutos à temperatura ambiente num agitador. Lave as amostras com água deionizada durante cinco minutos enquanto agita. Equilibrar as amostras em PBS.

Agora transfira as amostras para placas com tampas de rosca. Depois de preparar uma solução de anticorpos primários frescos para todas as amostras em um copo, adicione-a às amostras e incube a 37 graus Celsius por um a sete dias com agitação suave no escuro. Em seguida, coloque as amostras em tubos e lave-as usando PBST pré-aquecido a 37 graus Celsius na incubadora.

Mover as amostras para placas com tampas de rosca e adicionar anticorpos secundários preparados em PBST e azida sódica a 0,01%. Transfira as amostras para tubos e lave-as com PBST pré-aquecido três vezes a 37 graus Celsius por duas horas enquanto agita. Para correspondência do índice de refração, coloque as amostras em pratos novos e adicione 30% de solução de TDE.

Em seguida, substitua o TDE a 30% pela solução de TDE a 68% nas amostras e deixe-as à temperatura ambiente enquanto agitam. Após o curto processamento, obteve-se transparência ótima e homogênea de todos os cortes de tecido na substância cinzenta e branca.

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