Para começar, coloque o tecido dissecado de camundongo em um meio de cultura de células frias contendo 5% de SFB. Com tesoura de dissecação afiada, pique o tecido até obter fragmentos de aproximadamente cinco milímetros. Transfira os fragmentos picados para um tubo C e adicione um mililitro de meio de cultura celular.
Coloque o tubo C no dispositivo motorizado e encaixe a placa do suporte do tubo sobre os fundos do tubo em forma de D. Trave os braços de tensão na placa de acrílico para fixar os tubos à placa do motor. Para definir um programa personalizado no dispositivo motorizado no menu principal, pressione o botão azul para escolher o modo personalizado.
No primeiro menu de modo personalizado, pressione o botão verde para especificar a duração da rotação para frente para 30 segundos. Em seguida, pressione o botão azul para selecionar o valor na tela. No segundo menu do modo personalizado, pressione o botão verde para especificar a duração da rotação reversa para 10 segundos.
Em seguida, pressione o botão azul para selecionar o valor na tela. No terceiro menu de modo personalizado, pressione o botão vermelho para especificar os loops de seleção para quatro vezes. Em seguida, pressione o botão azul para selecionar o valor na tela.
Ajuste o seletor de controle de tensão para 200 RPM e inicie o programa personalizado. Em seguida, adicionar a enzima de digestão em quatro mililitros de meio de cultura frio contendo tecidos dissecados. Novamente, carregue o tubo C no dispositivo e repita o programa personalizado conforme demonstrado anteriormente.
Após a corrida, transfira o dispositivo com os tubos carregados para uma incubadora de 37 graus Celsius por 45 minutos. Em seguida, carregue o tubo C no dispositivo e defina o programa personalizado em 50 RPM com rotação para frente para 270 segundos. Inverter a rotação para 30 segundos e fazer um looping nove vezes.
Adicionar EDTA a uma concentração final de cinco milimolares à amostra. Defina o programa personalizado em 100 RPM com rotação para frente para 30 segundos. Inverta a rotação para 10 segundos e faça um looping duas vezes.
Em seguida, passe a suspensão celular através de um filtro de células de 70 micrômetros e colete o filtrado em um tubo de 50 ou 15 mililitros. Centrifugar a suspensão celular coletada a 300 G por cinco minutos a quatro graus Celsius e descartar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em um mililitro de tampão de lise de hemácias e incube por um minuto.
Neutralizar o tampão de lise com nove mililitros de PBS frio. Novamente, centrifugar as células e ressuspender o pellet no tampão ou meio desejado. A suspensão celular preparada com dispositivo motorizado e dissociação manual exibiu viabilidade celular comparável e rendimentos em tecidos pulmonares, renais e cardíacos de camundongos.
Populações de células imunes como células T e células dendríticas não foram significativamente afetadas pelo protocolo de isolamento. A expressão do marcador de superfície também mostrou frequências semelhantes de linfócitos T isolados na intensidade média de fluorescência para o marcador de apresentação do antígeno MHC II em células dendríticas entre o isolamento manual e do dispositivo.
