Para começar, coloque o tubo de 15 mililitros contendo o reagente de digestão enzimática de células pré-aquecidas em uma incubadora de 37 graus Celsius até o uso. Alíquota de 500 microlitros de PBS/EDTA recém-preparado nos poços de uma placa de 24 poços. Sob um microscópio de campo claro, observe o crescimento de organoides e transwells intestinais humanos tridimensionais diferenciados.
Transferir as inserções de cultura celular do meio de cultura para a solução de PBS/EDTA. Remova o meio de cultura do lado apical e substitua-o por 100 microlitros de PBS / EDTA sem perturbar a camada celular. Depois de descartar o PBS / EDTA, remova o inserto do poço, seque-o suavemente na borda de uma toalha de papel e invertado na bancada.
Usando uma lâmina de bisturi afiada, corte ao redor da circunferência interna da membrana para removê-la da inserção. Transfira a membrana com pinça para o tubo de 1,5 mililitro contendo 200 microlitros de reagente de digestão enzimática de células pré-aquecidas. Coloque a membrana por 30 minutos a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono.
A cada 10 minutos, pipetar todo o volume cinco vezes usando uma pipeta P 200. Transfira de um a dois microlitros de suspensão celular para uma lâmina de vidro a cada 10 minutos para avaliar a dissociação, avaliando qualitativamente a porcentagem de células individuais. Após a dissociação, combine três poços replicados por condição em um único tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Adicione 400 microlitros de meio de diferenciação de cultura de células contendo 10 inibidores de ROCK micromolares e misture delicadamente por pipetagem. Filtre todo o volume através de um filtro de ponta de 70 mícrons, coletando o fluxo em um tubo novo de 1,5 mililitro. Em seguida, filtre o fluxo obtido através de um filtro de 70 mícrons em um filtro de ponta de 40 mícrons.
Adicione cinco microlitros de azul de tripano a cinco microlitros de suspensão celular e conte as células individuais viáveis. Diluir a amostra com meio de cultura WRNE para obter 1.000 células por microlitro. Um total de 5.623 células únicas foram isoladas de organoides intestinais humanos jejunais diferenciados cultivados em inserções de cultura de células de membrana.
