Os autores reconhecem as bolsas U19 AI157984, U01 DK103168, U19 AI144297, P30 DK56338, P01 AI057788, U19 AI116497 e NASA Cooperative Agreement Notice/TRISH NNX16AO69A.

As linhagens organoides usadas aqui foram obtidas do Texas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core. Resumidamente, para estabelecer inicialmente as linhas organoides, amostras de tecido doador foram lavadas e digeridas enzimaticamente para liberar as criptas intestinais. As criptas foram embutidas em uma membrana basal e cultivadas em um meio. O Conselho de Revisão Institucional do Baylor College of Medicine aprovou o protocolo do estudo para obter amostras de tecido a partir das quais as linhas organoides foram estabelecidas, e o consentimento informado foi obtido de todos os doadores para estabelecer linhas organoides do tecido doado.
1. Passagem de HIOs 3D para expandir para diferenciação
<ol><li>Remova e descarte o meio de poços de organoides cultivados em placas de 24 poços (ao redor da membrana sólida do embasamento) com uma pipeta P1000. Adicione 300 μL de tripsina-EDTA a 0,05% ao poço e quebre mecanicamente os organoides pipetando com uma pipeta P1000 para cima e para baixo 5x.</li>
	<li>Incubar a placa a 37 °C durante 4 min. Adicione 500 μL de meio completo sem fatores de crescimento (meio CMGF) com 10% de FBS em cada poço (Tabela 1). Use uma pipeta P1000 e um meio CMGF pipeta e uma mistura HIO, 10x para frente e para trás no poço. Transfira todo o volume para um tubo de 15 mL. Combine a passagem de vários poços para o mesmo tubo de 15 mL. Não combine mais de 10 poços por tubo.</li>
	<li>Centrifugar as células a 4 °C utilizando uma centrífuga de rotor oscilante a 100 x g durante 5 min. Remova todo o meio, mantendo o pellet no fundo do tubo. Mantenha o tubo no gelo.</li>
	<li>Calcule a quantidade de membrana basal necessária para o número de HIO revestido e ressuspenda o pellet HIO em 30 μL / poço de membrana basal usando pontas de pipeta P200 frias. Pipete a mistura de membrana basal HIO como uma gota no centro de uma placa de 24 poços usando pontas de pipeta P200 frias.</li>
	<li>Transferir a placa para uma incubadora a 37 °C. Deixe a membrana basal solidificar por 5-10 min e, em seguida, adicione 500 μL de meio completo em temperatura ambiente contendo WNT, R-espondina Tabela 1) a cada poço e cultura em uma incubadora a 37 °C. Atualize a cultura com WRNE+Y em dias alternados por 7 dias. NOTA: Um HIO saudável terá formato cístico com um epitélio brilhante (Figura 2). As células no meio do cisto não podem ser visualizadas. Um HIO insalubre parecerá opaco e terá um epitélio espesso com um meio sólido. A característica mais importante é a aparência brilhante.</li>
</ol>2. Diferenciação HIO: formato 3D
<ol><li>Use um poço de HIOs 3D para 3 poços de HIOs diferenciados 3D 1 semana após o cultivo.</li>
	<li>Remova a mídia dos poços. Disperse a membrana basal e os HIOs usando uma pipeta P1000 e adicione 500 μL de CMGF- frio por poço e pipete para cima e para baixo pelo menos 5x. Gire HIOs a 4 ° C usando uma centrífuga de rotor oscilante a 100 x g por 5 min. Remova todo o meio mantendo o pellet no fundo do tubo.</li>
	<li>Adicione 30 μL de membrana basal por poço de HIOs em semeamento. Pipete a gota de 30 μL da membrana basal com HIOs em um poço de uma placa de 24 poços. Incubar a 37 °C durante 10 min. Adicione 500 μL de mídia WRNE+Y/Diff (50/50).</li>
	<li>Mude o meio para o meio de diferenciação após 24 h por mais 3 dias, atualizando o meio em dias alternados. Prepare 3 poços por amostra para agrupar para reduzir a variabilidade técnica.</li>
</ol>3. Diferenciação HIO: formato monocamada
<ol><li>Cubra as inserções de cultura de células de membrana ou alvéolos de uma placa de 96 poços com 100 μL / alvéolo de colágeno placentário humano IV (1 mg / ml em ácido acético 100 mM) diluído em H2O frio (1:30). Incubar a 37 °C durante um mínimo de 1,5 h ou no máximo durante a noite. Para inserção de cultura de células de membrana, adicione H2O estéril no espaço da placa para umidificar a placa; para placas de 96 poços, adicione H2O estéril nos poços não utilizados.</li>
	<li>Colete HIOs 3D cultivados em WRNE por 7 dias, removendo o meio e recuperando a membrana basal e as células adicionando 500 μL / poço de EDTA frio 0,5 mM (EDTA 0,5 M diluído 1: 1000 em PBS estéril). Use uma pipeta P1000 para pipetar organoides e solução para cima e para baixo 5x e transfira para um tubo de microcentrífuga de 15 mL. Não agrupe mais de 10 poços de organoides por tubo. Centrifugue durante 5 min a 300 x g num rotor de balde oscilante a 4 °C. NOTA: Para preparar 3 poços em uma placa de 96 poços, use 1 poço de HIOs 3D. Para preparar 1 inserção de cultura de células de membrana, use 1 poço de HIOs 3D (a densidade de semeadura de células únicas é de aproximadamente 1-2 x 105 células/poço para placa de 96 poços, 2,5-3 x 105 células/poço para inserção de cultura de células de membrana).</li>
	<li>Remova 500 μL de meio, deixando o pellet no fundo do tubo. Dissocie os HIOs adicionando 500 μL de tripsina a 0,05% / EDTA 0,5 mM e incubando por 4-5 min a 37 ° C. Pipete vigorosamente para cima e para baixo por ~ 50x usando um P1000. Evite fazer bolhas pipetando contra a lateral do tubo.</li>
	<li>Inative a tripsina adicionando 1 mL de CMGF contendo 10% de FBS. Filtre grandes aglomerados de células não digeridas umedecendo um filtro de células de 40 μm com 1 mL de CMGF contendo 10% de FBS e adicionando as células ao topo do filtro celular. Use a gravidade para permitir que as células passem pelo filtro e descarte o filtro de células que contém aglomerados de células.</li>
	<li>Colete as células por centrifugação por 5 min a 400 x g em um rotor de balde oscilante à temperatura ambiente.</li>
	<li>Remova o líquido do inserto de cultura de células de membrana revestida de colágeno ou da placa de 96 poços. Ressuspenda o pellet HIO em 100 μL / poço de WRNE contendo 10 μM Y-27632 e, em seguida, pipete para o compartimento superior do inserto de cultura de células de membrana ou para a placa de 96 poços. Para inserção de cultura de células de membrana, adicione 600 μL de WRNE contendo 10 μM Y-27632 no compartimento inferior do poço.</li>
	<li>Remova o meio após 24 h da parte superior e inferior da inserção de cultura de células de membrana ou da placa de 96 poços e substitua por meio de diferenciação por 5 dias. Prepare 3 poços por amostra para agrupar para reduzir a variabilidade técnica.</li>
</ol>4. Preparação de suspensões unicelulares a partir de HIOs 3D diferenciados para transcriptômica unicelular
<ol><li>Coloque o reagente de digestão enzimática de células a 37 °C em uma incubadora de CO2 para descongelar e aquecer 30 minutos antes do início da digestão 3D HIO. Verifique os HIOs usando um microscópio de campo claro a 10x para garantir a saúde da célula.</li>
	<li>Remova o meio dos poços e adicione 500 μL de solução de recuperação de células frias aos poços. Pipete para cima e para baixo algumas vezes para liberar as células da membrana basal usando uma pipeta P1000 e pontas de pipeta padrão. Transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. NOTA: O uso de poços replicados garante um número adequado de células e reduz a variação de poço para poço. Não combine poços antes da etapa 4.7 abaixo.</li>
	<li>Incube os tubos das células no gelo por 10 min, pipetando para cima e para baixo a cada 5 min. Coletar as células por centrifugação por 3 min a 400 x g a 4 °C.</li>
	<li>Remova o líquido do tubo, tomando cuidado para não perturbar o pellet celular. Ressuspenda as células em 500 μL de reagente de digestão celular enzimática pré-aquecido. Pipete para cima e para baixo com um P1000 pelo menos 10x.</li>
	<li>Incubar os HIOs durante 30 min a 37 °C numa incubadora de CO2 . A cada 10 min, pipete todo o volume 10x usando uma pipeta P1000 para ajudar a dissociar as células. Evite introduzir bolhas de ar na suspensão da célula.</li>
	<li>Pulverize as células por 3 min a 400 x g a 4 °C. Remova o sobrenadante, ressuspenda as células em 1 mL de meio de diferenciação e armazene no gelo. NOTA: A partir deste ponto, os HIOs devem ser mantidos sempre no gelo.</li>
	<li>Pipete as células para cima e para baixo 50x rapidamente usando um P1000 para garantir que os HIOs sejam dissociados em células únicas. Tome cuidado para não introduzir bolhas de ar nesta etapa, pois isso causará perda de células.</li>
	<li>Filtre todo o volume através de um filtro de ponta de 70 μm usando uma ponta de pipeta P1000. Use um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para coletar o eluído. NOTA: A ponta do filtro não ficará entupida se o tempo de digestão for suficiente. Use várias pontas de filtro se o filtro ficar entupido; Não force o volume através do filtro.</li>
	<li>Repita a etapa 4.8 com um filtro de ponta de 40 μm. Armazene amostras no gelo.</li>
	<li>Conte células individuais viáveis em uma câmara de contagem de células usando a exclusão de azul de tripano, adicionando 5 μL de azul de tripano a 0,4% a 5 μL de suspensão celular. Diluir a amostra conforme necessário para 1000 células/μL. Se a densidade celular for inferior a 1000 células/μL, pellet cells por 2 min a 400 x g a 4 °C, remova o meio original e ressuspenda no meio de cultura celular. Este protocolo normalmente produz 5 x 105-1 x 106 células. NOTA: A preparação de uma suspensão de alta qualidade (90% viável e 90% de células únicas) é essencial para dados de célula única de alta qualidade. No entanto, a experiência indica que a viabilidade de até 75% pode ser aceita nos casos em que o tratamento, como infecção ou aplicação de pequenas moléculas, afeta a viabilidade.</li>
	<li>Prepare bibliotecas de DNA para plataformas de perfil transcricional de célula única de acordo com os protocolos do fabricante. Processe os dados de acordo com os protocolos de melhores práticas para análise de dados scRNAseq13,14.</li>
</ol>5. Preparação de suspensões unicelulares a partir de HIOs diferenciados em inserto de cultura de células de membrana
<ol><li>Coloque o reagente de digestão celular enzimática a 37 °C em uma incubadora de CO2 para descongelar e aquecer 30 minutos antes do início da digestão da inserção de cultura de células de membrana HIO. Divida o reagente de digestão celular enzimática pré-aquecido em alíquotas de 200 μL em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, 1 tubo por inserto de cultura de células de membrana. Manter os tubos na incubadora a 37 °C até estarem prontos a ser utilizados.</li>
	<li>Prepare PBS-EDTA adicionando 5 μL de EDTA 0,5 M a 5 mL de PBS. Alíquota de 500 μL de PBS-EDTA em uma placa de 24 poços, 1 poço por inserto de cultura de células de membrana.</li>
	<li>Lave as células com PBS-EDTA: transfira as inserções de cultura de células de membrana de alvéolos contendo meios de crescimento para os alvéolos contendo PBS-EDTA. Remover o meio de cultura celular do lado apical e substituí-lo por 100 μL de PBS-EDTA. Tome cuidado para não perturbar a camada celular.</li>
	<li>Descarte imediatamente o PBS-EDTA adicionado ao lado apical das inserções de cultura de células de membrana. Remova a inserção de cultura de células de membrana do poço, seque-a tocando suavemente a borda em uma toalha de papel e, em seguida, inverta-a na bancada. Use uma lâmina de bisturi afiada para remover a membrana da pastilha, cortando ao redor da circunferência interna da membrana. Trabalhe rapidamente para evitar o ressecamento.</li>
	<li>Use uma pinça para transferir a membrana para o tubo de microcentrífuga pré-aquecido de 1,5 mL preenchido com reagente de digestão enzimática de células e certifique-se de que a membrana esteja completamente submersa. Repita para todas as inserções adicionais de cultura de células de membrana. NOTA: Aumentar o volume do reagente de digestão enzimática celular para 500 μL pode ajudar a dissociar monocamadas densas.</li>
	<li>Dissociar as células incubando tubos com membranas a 37 °C numa incubadora de CO2 . Misture pipetando suavemente todo o volume 5x com uma pipeta de 200 μL a cada 10 min para um total de 30 min. Evite bolhas e sucção da membrana para preservar a viabilidade.</li>
	<li>Transfira uma pequena alíquota de células (1-2 μL) para uma lâmina de vidro a cada 10 minutos para avaliar a dissociação, avaliando qualitativamente a porcentagem de células individuais. Pode levar até 50 minutos com pipetagem adicional para atingir 80% -90% de células únicas, dependendo do tipo de HIO. Raspe suavemente a membrana com uma ponta de pipeta durante as etapas de mistura para estimular a dissociação, principalmente para células difíceis de dissociar, no entanto, a raspagem pode afetar a viabilidade.</li>
	<li>Combine 3 poços replicados por condição em um único tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (600 μL no total). Adicione 400 μL de meio de cultura celular (diff) + 10 μM de ROCKi (1 mL de volume total). Misture delicadamente pipetando. NOTA: O uso de poços replicados garante um número adequado de células e reduz a variação de poço para poço. Os poços devem ser agrupados nesta etapa.</li>
	<li>Filtre todo o volume através de um filtro de ponta de 70 μm usando uma ponta de pipeta de 1 mL. Colete o fluxo em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. NOTA: A ponta do filtro não ficará entupida se o tempo de digestão for suficiente. Use várias pontas de filtro se o filtro ficar entupido; não force a passagem do volume.</li>
	<li>Repita a etapa 5.9 com um filtro de ponta de 40 μm. Armazene amostras no gelo.</li>
	<li>Conte células individuais viáveis em uma câmara de contagem de células usando a exclusão de azul de tripano, adicionando 5 μL de azul de tripano a 0,4% a 5 μL de suspensão celular. Dilua a amostra conforme necessário para 1000 células/μL. Se a densidade celular for inferior a 1000 células/μL, gire 2 min a 400 x g a 4 °C para granular as células, remova o meio original e ressuspenda em WRNE+Y na densidade celular desejada. Este protocolo normalmente produz 4 x 105 - 6 x 105 células. NOTA: A preparação de suspensão de alta qualidade (90% viável e 90% de células únicas) é essencial para dados de célula única de alta qualidade. No entanto, a experiência indica que a viabilidade de até 75% pode ser aceita nos casos em que o tratamento, como infecção ou aplicação de pequenas moléculas, afeta a viabilidade.</li>
	<li>Prepare bibliotecas de DNA para as plataformas de perfil transcricional de célula única de acordo com os protocolos do fabricante. Processe os dados de acordo com os protocolos de melhores práticas para análise de dados scRNAseq13,14.</li>
</ol>6. Preparação de suspensões unicelulares a partir de HIOs diferenciados como monocamadas de 96 poços
<ol><li>Coloque o reagente de digestão enzimática celular a 37 °C em uma incubadora de CO2 para descongelar e aquecer 30 minutos antes do início da digestão HIO em monocamada.</li>
	<li>Prepare PBS-EDTA adicionando 5 μL de EDTA 0,5 M a 5 mL de PBS. Descarte o meio de cultura de células da placa de 96 poços e substitua-o por 100 μL de PBS-EDTA. Tome cuidado para não perturbar a camada celular.</li>
	<li>Dissocie as células: Descarte o PBS-EDTA e adicione 100 μL de reagente de digestão celular enzimática quente a cada poço. Coloque a placa a 37 °C em uma incubadora de CO5% 2 e misture pipetando suavemente todo o volume 5x com uma ponta de pipeta de 200 μL a cada 10 min por 20-30 min. Evite bolhas para preservar a viabilidade. NOTA: Aumentar o volume do reagente de digestão celular enzimática para 500 μL pode ajudar na dissociação de monocamadas densas.</li>
	<li>Transfira uma pequena alíquota de células (1-2 μL) para uma lâmina de vidro a cada 10 minutos para avaliar a dissociação. Pode levar até 50 minutos para atingir 80% -90% de células únicas, dependendo do tipo de HIO. Raspe suavemente a placa com uma ponta de pipeta durante as etapas de mistura para estimular a dissociação, principalmente para células difíceis de dissociar; no entanto, a raspagem pode afetar a viabilidade.</li>
	<li>Combine 3 poços replicados por condição em um único tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (300 μL no total). Adicione 700 μL de meio de cultura celular (diff) + 10 uM ROCKi (1 mL de volume total). Misture delicadamente pipetando. NOTA: O uso de poços cultivados replicados garante um número adequado de células e reduz a variação de poço para poço.</li>
	<li>Filtre todo o volume através de um filtro de ponta de 70 μm usando uma ponta de pipeta de 1 mL. Colete o fluxo em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. NOTA: A ponta do filtro não ficará entupida se o tempo de digestão do reagente de digestão enzimática das células for suficiente. Use várias pontas de filtro se o filtro ficar entupido; não force a passagem do volume.</li>
	<li>Repita a etapa 6.6 com um filtro de ponta de 40 μm. Armazene amostras no gelo.</li>
	<li>Conte células individuais viáveis em uma câmara de contagem de células usando a exclusão de azul de tripano, adicionando 5 μL de azul de tripano a 0,4% a 5 μL de suspensão celular. Diluir conforme necessário para 1000 células/μL. Se a densidade celular for inferior a 1000 células/μL, gire 2 min a 400 x g 4 °C para granular as células, remova o meio original e ressuspenda em meio de cultura celular + ROCKi na densidade celular desejada. Este protocolo normalmente produz 2 x 105 - 6 x 105 células. NOTA: A preparação de suspensão de alta qualidade (90% viável e 90% de células únicas) é essencial para dados de célula única de alta qualidade. No entanto, a experiência indica que a viabilidade de até 75% pode ser aceita nos casos em que o tratamento, como infecção ou aplicação de pequenas moléculas, afeta a viabilidade.</li>
	<li>Prepare bibliotecas de DNA de acordo com os protocolos do fabricante da plataforma de perfil transcricional de célula única. Processe os dados de acordo com os protocolos de melhores práticas para análise de dados scRNAseq13,14.</li>
</ol>

Integrando transcriptômica de célula única com organoides intestinais humanos

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Blutt, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+microphysiological+systems.">Gastrointestinal microphysiological systems.</a> Exp Biol Med. 242 (16), 1633-1642 (2017).</li><li>VanDussen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enhanced+human+gastrointestinal+epithelial+culture+system+to+facilitate+patient-based+assays.">Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays.</a> Gut. 64 (6), 911-920 (2015).</li><li>Elmentaite, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+of+the+human+intestinal+tract+mapped+across+space+and+time.">Cells of the human intestinal tract mapped across space and time.</a> Nature. 597 (7875), 250-255 (2021).</li><li>Hickey, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+human+intestine+at+single-cell+resolution.">Organization of the human intestine at single-cell resolution.</a> Nature. 619 (7970), 572-584 (2023).</li><li>Burclaff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proximal-to-distal+survey+of+healthy+adult+human+small+intestine+and+colon+epithelium+by+single-cell+transcriptomics.">A proximal-to-distal survey of healthy adult human small intestine and colon epithelium by single-cell transcriptomics.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (5), 1554-1589 (2022).</li><li>Triana, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+reveals+immune+response+of+intestinal+cell+types+to+viral+infection.">Single-cell transcriptomics reveals immune response of intestinal cell types to viral infection.</a> Mol Syst Biol. 17 (7), e9833 (2021).</li><li>Triana, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analyses+reveal+SARS-CoV-2+interference+with+intrinsic+immune+response+in+the+human+gut.">Single-cell analyses reveal SARS-CoV-2 interference with intrinsic immune response in the human gut.</a> Mol Syst Biol. 17 (4), e10232 (2021).</li><li>Fujii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intestinal+organoids+maintain+self-renewal+capacity+and+cellular+diversity+in+niche-inspired+culture+condition.">Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2021).</li><li>Beumer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+gradient+along+the+intestinal+villus+axis+controls+zonated+enterocyte+and+goblet+cell+states.">BMP gradient along the intestinal villus axis controls zonated enterocyte and goblet cell states.</a> Cell Rep. 38 (9), 110438 (2022).</li><li>Beumer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mRNA+and+secretome+atlas+of+human+enteroendocrine+cells.">High-resolution mRNA and secretome atlas of human enteroendocrine cells.</a> Cell. 182 (4), 1062-1064 (2020).</li><li>Busslinger, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gastrointestinal+epithelia+of+the+esophagus,+stomach,+and+duodenum+resolved+at+single-cell+resolution.">Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution.</a> Cell Rep. 34 (10), 108819 (2021).</li><li>Luecken, M. D., Theis, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+best+practices+in+single-cell+RNA-seq+analysis:+a+tutorial.">Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial.</a> Mol Syst Biol. 15 (6), e8746 (2019).</li><li>Heumos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+for+single-cell+analysis+across+modalities.">Best practices for single-cell analysis across modalities.</a> Nat Rev Genet. 24 (8), 550-572 (2023).</li></ol>

Os autores não têm conflitos de interesse.

Usando plataformas genômicas de célula única, sistemas biológicos complexos, como culturas HIO derivadas de tecidos que modelam o epitélio intestinal, podem ser divididos para produzir contribuições celulares individuais para a resposta biológica geral 4,5,6. A heterogeneidade celular e as populações de células raras também podem ser identificadas e interrogadas. A entrada celular precisa ser otimizada para maximizar...

O epitélio do intestino delgado possui duas zonas distintas: a cripta que abriga a célula-tronco intestinal (CEI) e a vilosidade, que é composta por células diferenciadas das linhagens secretora e absortiva. Somando-se a essa complexidade está a especificidade regional do epitélio que fornece propriedades funcionais únicas entre as regiões do intestino delgado. Trabalhos pioneiros estabeleceram condições de cultura nas quais tanto a cripta do intestino delgado humano quanto as zonas de vilosidades podem ser geradas ex vivo a partir de tecidos cirúrgicos ou biópsias de tecidos1. Essas culturas estão preenchendo a lacuna entre estudos em animais e ensaios clínicos e estão revelando biologia celular, bioquímica e fisiologia do trato gastrointestinal anteriormente não reconhecidas. Os HIOs são propagados como estruturas esféricas 3D usando um meio com fatores de crescimento que promovem a viabilidade de células-tronco e matrizes de suporte extracelular. Essas condições resultam em um modelo HIO semelhante a uma cripta que consiste principalmente de progenitores e células-tronco. A remoção dos fatores de crescimento promove a diferenciação do ISC (modelo semelhante a vilosidades) e a produção de células epiteliais intestinais maduras (caliciforme, enteroendócrino, tufo, enterócito) em proporções apropriadas, juntamente com proliferação e diferenciação celular, polarização, integridade da barreira, características específicas regionais e respostas fisiológicas apropriadas2. As culturas HIO são geneticamente estáveis e podem ser propagadas indefinidamente em seu estado semelhante a uma cripta. O fácil acesso à superfície apical dessas culturas é proporcionado pelas condições de cultivo que permitem o crescimento em formato monocamada3. Os HIOs também permitem que considerações sobre a variabilidade individual do hospedeiro, como genética, idade, sexo, etnia e estado da doença, sejam incluídas nas análises biológicas. As ferramentas de avaliação analítica e funcional são idênticas às usadas em abordagens centradas em linhagens celulares transformadas e incluem uma variedade de técnicas moleculares, como citometria de fluxo, microscopia, transcriptômica, proteômica e metabolômica.
A transcriptômica de célula única está revolucionando nossa compreensão da biologia e fisiologia do intestino delgado, fornecendo informações sobre as contribuições individuais de cada tipo de célula para um processo biológico. O trabalho pioneiro usando essa tecnologia forneceu uma paisagem dos tipos de células presentes no intestino humano nativo 4,5,6. As plataformas de perfil transcricional de célula única permitem a exploração da paisagem transcricional de células individuais, permitindo que a heterogeneidade celular venha à vanguarda da exploração científica. Em algumas plataformas de perfil transcricional de célula única, o particionamento microfluídico e o código de barras são usados para gerar bibliotecas de cDNA a partir de mRNAs poliadenilados celulares obtidos de até 10.000 células por amostra. Nesta plataforma, gotículas contendo células únicas, oligonucleotídeos com código de barras, reagentes de transcrição reversa e óleo formam uma vesícula de reação que resulta em todos os cDNAs de uma única célula com o mesmo código de barras. Os cDNAs com código de barras podem então ser sequenciados com eficiência usando sequenciamento de próxima geração. Os dados gerados podem ser manipulados por meio de software e ferramentas de visualização, que convertem as sequências com código de barras em mapas de visualização e perfis transcricionais de célula única. As populações de células podem ser identificadas usando bancos de dados publicamente disponíveis do epitélio do intestino delgado humano 4,5,6. Embora muitos estudos tenham utilizado esta plataforma para interrogar organoides intestinais murinos no nível de célula única, a análise das respostas transcricionais de células únicas de HIOs ficou para trás 7,8,9,10,11,12.
Aqui, fornecemos um guia passo a passo para isolar células viáveis de HIOs do intestino delgado para processamento em plataformas de perfil transcricional de célula única (Figura 1). Fornecemos diretrizes de cultura e diferenciação, juntamente com componentes de mídia que foram otimizados para diferenciação epitelial. Descrevemos métodos de recuperação celular para três formatos de cultura diferentes: culturas tridimensionais (3D) e monocamadas em plástico ou em inserções de cultura de células de membrana. Fornecemos dados de agrupamento de amostras obtidos usando software de código aberto para derivar genes diferencialmente expressos em cada cluster.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>[Leu15]-Gastrin I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan blue</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS Ca- Mg-</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm Transwell</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well Nunclon delta surface tissue culture dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Flowmi tip strainer</td>
			<td>SP Bel-Art Labware</td>
			<td>H13680-0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Flowmi tip strainer</td>
			<td>SP Bel-Art Labware</td>
			<td>H13680-0070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#8217; GEM, Library &#38; Gel Bead Kit v3.1</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN-1000128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5533-5MG</td>
			<td>33 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Recovery Solution&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Mg2-, Ca2-)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-136</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-WRN conditioned media</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, GFR, phenol free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse recombinant EGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PMG8043</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td>500 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72308</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using human intestinal organoids to understand the small intestine epithelium at the single cell transcriptional level

A transcriptômica de célula única revolucionou nossa compreensão da biologia celular do corpo humano. As culturas organoides do intestino delgado humano de última geração fornecem sistemas modelo ex vivo que preenchem a lacuna entre modelos animais e estudos clínicos. A aplicação da transcriptômica de célula única a modelos de organoides intestinais humanos (HIO) está revelando biologia celular, bioquímica e fisiologia do trato gastrointestinal anteriormente não reconhecidas. As plataformas avançadas de transcriptômica de célula única usam particionamento microfluídico e código de barras para gerar bibliotecas de cDNA. Esses cDNAs com código de barras podem ser facilmente sequenciados por plataformas de sequenciamento de última geração e usados por várias ferramentas de visualização para gerar mapas. Aqui, descrevemos métodos para cultivar e diferenciar HIOs do intestino delgado humano em diferentes formatos e procedimentos para isolar células viáveis desses formatos que são adequados para uso em plataformas de perfil transcricional de célula única. Esses protocolos e procedimentos facilitam o uso de HIOs do intestino delgado para obter uma maior compreensão da resposta celular do epitélio intestinal humano no nível transcricional no contexto de uma variedade de ambientes diferentes.

The small intestinal epithelium has two distinct zones: the crypt that houses the intestinal stem cell (ISC) and the villus, which is comprised of differentiated cells of the secretory and absorptive lineages. Adding to this complexity is the regional specificity of the epithelium that provides unique functional properties between the regions of the small intestine. Pioneering work established culture conditions in which both the human small intestinal crypt and villus zones can be generated ex vivo from surgical tissues or tissue biopsies1. These cultures are bridging the gap between animal studies and clinical trials and are revealing previously unrecognized cell biology, biochemistry, and physiology of the gastrointestinal tract. The HIOs are propagated as 3D spherical structures using a media with growth factors that promote stem cell viability and extracellular support matrices. These conditions result in a crypt-like HIO model that consists mostly of progenitors and stem cells. Removal of the growth factors promotes ISC differentiation (villus-like model) and production of mature intestinal epithelial cells (goblet, enteroendocrine, tuft, enterocyte) in appropriate ratios along with cell proliferation and differentiation, polarization, barrier integrity, regional specific features, and appropriate physiological responses2. HIO cultures are genetically stable and can be propagated indefinitely in their crypt-like state. Easy access to the apical surface of these cultures is provided by culture conditions that allow growth in a monolayer format3. HIOs also allow considerations of host individual variability such as genetics, age, sex, ethnicity, and disease status to be included in biological analyses. Analytic and functional assessment tools are identical to those used in approaches centered on transformed cell lines and include a variety of molecular techniques such as flow cytometry, microscopy, transcriptomics, proteomics, and metabolomics.
Single cell transcriptomics is revolutionizing our understanding of the biology and physiology of the small intestine by providing insight into the individual contributions of each cell type to a biological process. Pioneering work using this technology has provided a landscape of the cell types present in the native human intestine4,5,6. Single cell transcriptional profiling platforms allow exploration of the transcriptional landscape of individual cells, allowing cell heterogeneity to come to the forefront of scientific exploration. In some single cell transcriptional profiling platforms, microfluidic partitioning and barcoding are used to generate cDNA libraries from cellular polyadenylated mRNAs obtained from up to 10,000 cells per sample. On this platform, droplets containing single cells, barcoded oligonucleotides, reverse transcription reagents, and oil form a reaction vesicle that results in all cDNAs from a single cell having the same barcode. The barcoded cDNAs can then be efficiently sequenced using next generation sequencing. Data generated can be handled through software and visualization tools, which convert the barcoded sequences into visualization maps and single cell transcriptional profiles. Cell populations can be identified using publicly available databases of human small intestinal epithelium4,5,6. Although many studies have utilized this platform to interrogate murine intestinal organoids at the single cell level, the analysis of single cell transcriptional responses of HIOs has lagged behind7,8,9,10,11,12.
Here, we provide a step-by-step guide to isolating viable cells from small intestinal HIOs for processing on single cell transcriptional profiling platforms (Figure 1). We provide culturing and differentiation guidelines along with media components that have been optimized for epithelial differentiation. We outline cell recovery methods for three different culture formats: three dimensional (3D) and monolayer cultures either on plastic or on membrane cell culture inserts. We provide sample clustering data obtained using open-source software to derive differentially expressed genes in each cluster.

Autor em destaque: Integrando transcriptômica de célula única com culturas organoides para pesquisa avançada e insights terapêuticos

Usando organoides intestinais humanos para entender o epitélio do intestino delgado no nível transcricional de uma única célula

We are integrating single-cell transcriptomics and organoid technology to better understand the biology of the small intestine. These technologies are allowing us deeper insight into the cellular heterogeneity that exists within that tissue. The tools that improve the throughput, sensitivity, and the resolutions are the keys that advanced research in the field.Some examples are improved computational methods and the technological innovations. Cost reductions also a major focus. The process of preparing and sequencing the libraries of samples can cause transcription variations, which is one challenge.For organoids, specific challenges include limited spatial context or information about temporal dynamics. Single-cell analysis of the human intestinal organoids provides previously unattainable information into the cell types that make up the intestinal epithelium. This, thereby, opens the window to the transcriptional landscape of those cells.We are using these technologies to identify biomarkers and mechanisms of human intestinal diseases. These biomarkers and mechanisms will advance our ability to utilize personalized medicine-based approaches to treat human disease and improve human health overall.

As suspensões unicelulares foram agrupadas de 2-3 poços de inserção de cultura de células de membrana, monocamada e HIOs 3D para garantir rendimento celular suficiente e reduzir a variação de poço para poço. Bibliotecas de células únicas foram preparadas usando reagentes específicos para a plataforma de perfil transcricional de célula única. e sequenciado com leituras finais emparelhadas em uma plataforma de sequenciamento de última geração, 30.000 leituras/célula. As leituras foram mapeadas, contadas e...

O protocolo combina a tecnologia organoide intestinal humana com análise transcriptômica de célula única para fornecer informações significativas sobre a biologia intestinal anteriormente inexplorada.

Single cell transcriptomics has revolutionized our understanding of the cell biology of the human body. State-of-the-art human small intestinal organoid ...

using-human-intestinal-organoids-to-understand-small-intestine

Research

JoVE Journal

Biology

Using Human Intestinal Organoids to Understand the Small Intestine Epithelium at the Single Cell Transcriptional Level

406 visualizações.  Baylor College of Medicine. Estamos integrando transcriptômica de célula única e tecnologia organoide para entender melhor a biologia do intestino delgado. Essas tecnologias estão nos permitindo uma visão mais profunda da heterogeneidade celular que existe dentro desse tecido. As ferramentas que melhoram o rendimento, a sensibilidade e as resoluções são as chaves que avançam na pesquisa no campo.Alguns exemplos são os métodos computacionais aprimorados e as inovações...

Vídeo: Autor em destaque: Integrando transcriptômica de célula única com culturas organoides para pesquisa avançada e insights terapêuticos

Single cell transcriptomics has revolutionized our understanding of the cell biology of the human body. State-of-the-art human small intestinal organoid cultures provide ex vivo model systems that bridge the gap between animal models and clinical studies. The application of single cell transcriptomics to human intestinal organoid (HIO) models is revealing previously unrecognized cell biology, biochemistry, and physiology of the GI tract. The advanced single cell transcriptomics platforms use microfluidic partitioning and barcoding to generate cDNA libraries. These barcoded cDNAs can be easily sequenced by next generation sequencing platforms and used by various visualization tools to generate maps. Here, we describe methods to culture and differentiate human small intestinal HIOs in different formats and procedures for isolating viable cells from these formats that are suitable for use in single-cell transcriptional profiling platforms. These protocols and procedures facilitate the use of small intestinal HIOs to obtain an increased understanding of the cellular response of human intestinal epithelium at the transcriptional level in the context of a variety of different environments.

The protocol combines human intestinal organoid technology with single cell transcriptomic analysis to provide significant insight into previously unexplored intestinal biology.

Biologia

Preparation of Single Cell Suspensions from Differentiated 3D Human Intestinal Organoids for Single Cell Transcriptomics

To begin, thaw the enzymatic cell digestion reagent at 37 degrees Celsius for 30 minutes. Under a brightfield microscope at 10x magnification, observe the differentiated three-dimensional human intestinal organoids to ensure cell health. Replace the media from the wells of a 24-well plate containing differentiated organoids with 500 microliters of cold cell recovery solution.Pipette up and down to release the cells from the basement membrane. Transfer the cell suspension to a 1.5-milliliter microcentrifuge tube. Incubate the tube on ice for 10 minutes, pipetting up and and down every five minutes.Centrifuge the cell suspension at 400 g for three minutes at four degrees Celsius. Remove the supernatant from the tube without disturbing the pellet. Resuspend the pellet in 500 microliters of prewarmed enzymatic cell digestion reagent, pipetting up and down 10 times.Place the organoids for 30 minutes at 37 degrees Celsius in a carbon dioxide incubator. Every 10 minutes, pipette the entire volume 10 times using a P1000 pipette to help dissociate the cells. Centrifuge the cell suspension at 400 g for three minutes at four degrees Celsius, and resuspend the pellet in one milliliter of differentiation media.Rapidly pipette the cells up and down 50 times on ice to dissociate organoids into single cells. Filter the entire volume through a 70 micron tip strainer and collect the eluate in a fresh 1.5-milliliter tube. Then filter the eluate obtained through a 70 micron strainer on a 40 micron tip strainer.Add five microliters of 0.4%Trypan Blue to five microliters of cell suspension, and count viable single cells using Trypan Blue Exclusion. Dilute the sample with cell culture media to obtain 1000 cells per microliter. A total of 4, 402 single cells were isolated from differentiated ileal three-dimensional human intestinal organoids, representing expected cell types, including absorptive enterocytes and secretory cells.

Preparação de Suspensões de Células Únicas a partir de Organoides Intestinais Humanos 3D Diferenciados para Transcriptômica de Célula Única

Preparation of Single Cell Suspensions from Human Intestinal Organoids Differentiated on Membrane Cell Culture Insert

To begin, place the 15 milliliter tube containing prewarmed enzymatic cell digestion reagent in a 37 degree Celsius incubator until use. Aliquot 500 microliters of freshly prepared PBS/EDTA into the wells of a 24 well plate. Under a brightfield microscope, observe the growth of differentiated three dimensional human intestinal organoids and transwells.Transfer the cell culture inserts from the growth media to the PBS/EDTA solution. Remove the culture media from the apical side and replace it with 100 microliters of PBS/EDTA without disturbing the cell layer. After discarding PBS/EDTA, remove the insert from the well, blot it gently onto the edge of a paper towel and inverted on the bench top.Using a sharp scalpel blade, cut around the inner circumference of the membrane to remove the membrane from the insert. Transfer the membrane with forceps to the 1.5 milliliter tube containing 200 microliters of prewarmed enzymatic cell digestion reagent. Place the membrane for 30 minutes at 37 degrees Celsius in a carbon dioxide incubator.Every 10 minutes, pipette the entire volume five times using a P 200 pipette. Transfer, one to two microliters of cell suspension to a glass slide every 10 minutes to assess dissociation by qualitatively assessing the percentage of single cells. After dissociation, combine three replicate wells per condition in a single 1.5 milliliter micro centrifuge tube.Add 400 microliters of cell culture differentiation medium containing 10 micromolar ROCK inhibitor and mix gently by pipetting. Filter the entire volume through a 70 micron tip strainer, collecting the flowthrough in a fresh 1.5 milliliter tube. Then filter the flowthrough obtained through a 70 micron strainer on a 40 micron tip strainer.Add five microliters of 0.4%trypan blue to five microliters of cell suspension and count viable single cells. Dilute the sample with WRNE growth medium to obtain 1, 000 cells per microliter. A total of 5, 623 single cells were isolated from differentiated jejunal human intestinal organoids grown on membrane cell culture inserts.

Preparação de Suspensões de Células Únicas a partir de Organoides Intestinais Humanos Diferenciadas em Inserção de Cultura de Células de Membrana

Preparation of Single Cell Suspensions from Human Intestinal Organoids Differentiated as 96 Well Monolayers

To begin, prepare enzymatic cell digestion reagent and PBS/EDTA for human intestinal organoids digestion. Under a brightfield microscope, confirm the growth of differentiated three-dimensional human intestinal organoids as monolayers. Discard the cell culture media from monolayer culture and replace it with 100 microliters of PBS/EDTA.After removing PBS/EDTA, add 100 microliters of warm enzymatic cell digestion reagent to each well. Place the plate at 37 degrees Celsius in 5%carbon dioxide incubator and pipette the entire volume five times every 10 minutes for 20 to 30 minutes. Transfer one to two microliters of cell suspension to a glass slide every 10 minutes to assess dissociation by observing the percentage of single cells.After dissociation, combine three replicate wells per condition in a single 1.5 milliliter microcentrifuge tube. Add 700 microliters of cell culture differentiation medium containing 10 micromolar ROCK inhibitor, and mixed gently by pipetting. Filter the entire volume through a 70 micron tip strainer, collecting the flow-through in a fresh 1.5 milliliter tube.Filter the flow-through obtained through a 70 micron strainer on a 40 micron tip strainer. Add five microliters of 0.4%Trypan Blue to five microliters of cell suspension, and count viable single cells. Dilute the sample with cell culture media containing ROCK inhibitor to obtain 1, 000 cells per microliter.A total of 9, 952 single cells were isolated from differentiated intestinal human intestinal organoids grown in 96 well plates.