Para começar, coloque HEK293T células adicionando 22 mililitros de meio de cultura suplementado em 10 placas de cultura tratadas de 15 centímetros de diâmetro. Incube as placas por 24 horas para atingir 70 a 80% de confluência. Para a transfecção celular, prepare uma mistura combinando os reagentes em um tubo de microcentrífuga e misture batendo.
Adicione a mistura de transfecção a 4,56 mililitros de DMEM não suplementado em um tubo de centrífuga de 50 mililitros e misture batendo. Em seguida, adicione 1,37 mililitros de solução estéril de polietilenoimina gota a gota. Misture batendo e incube em temperatura ambiente por 10 minutos para formar complexos de DNA polietilenoimina.
Adicione esta mistura em 231 mililitros de DMEM suplementado pré-aquecido. Substitua o meio de cultura em cada placa de cultura por 22 mililitros dessa mistura de transfecção e incube as células por 48 horas. Se o PITR codificar um repórter fluorescente, observe as células transfectadas sob um microscópio de fluorescência.
Em seguida, colete o meio de cada prato. Centrifugue a 800G por 10 minutos e remova o sobrenadante. Em seguida, adicione 10 mililitros de PBS pré-aquecido à placa e use um raspador de células para remover as células.
Recolher a suspensão celular nos tubos de centrifugação que contêm o sedimento celular. Certifique-se de que todas as células sejam coletadas lavando cinco pratos de cada vez com 10 mililitros de PBS. Centrifugue novamente para peletar as células.
Para extração de rAAV, descongele os grânulos de células transfectadas e ressuspenda em 100 mililitros de tampão estéril e pipeta para garantir uma suspensão homogênea. Em seguida, adicione 12,5 mililitros de uma solução estéril de desoxicolato de sódio a 10% recém-preparada para induzir a lise celular e misture por pipetagem. Adicione 27 microlitros de nuclease de Benzonase e misture bem até que a mistura não fique mais viscosa.
Incubar a 37 graus Celsius, vórtice a cada 10 minutos, por uma hora. Centrifugue a 3.000 G por 60 minutos a 25 graus Celsius. Filtre o sobrenadante usando um filtro de seringa de PVDF de 0,45 mícron em um novo recipiente estéril.
