Para começar, prepare o sistema FPLC para purificação. Enxágue bem o caminho do fluxo do líquido com água ultrapura estéril usando instruções manuais ou um método personalizado. Conecte uma coluna de heparina pré-embalada de um mililitro.
Ajuste o alarme de pressão. E lave com cinco volumes de coluna de água ultrapura a uma vazão de um mililitro por minuto. Em seguida, troque as soluções para bombas de sistema para se preparar para a aplicação da amostra.
Lave a bomba do sistema B com o tampão B e preencha o restante do caminho do fluxo de líquido com o tampão A. Insira o sample tubo da sample bomba na preparação viral. Como alternativa, use um super loop para a amostra. Insira a tubulação de saída em um novo recipiente.
Ao realizar a purificação pela primeira vez, defina um método personalizado para purificação automática. Depois de habilitar as configurações gerais de purificação, o método preparará o caminho do fluxo da entrada de amostra S1 para a válvula de injeção com a solução de amostra. Em seguida, equilibre a coluna com um total de cinco volumes de coluna usando 12,5% do Buffer B a uma taxa de um mililitro por minuto.
Aplique a amostra na coluna a 0,5 mililitros por minuto e colete o fluxo usando a porta de saída. Lave a coluna com 20 volumes de coluna de tampão A a um mililitro por minuto. Em seguida, eluir a amostra a um mililitro por minuto com este esquema.
Selecione para coletar a amostra eluída em frações de um mililitro usando um coletor de frações. Em seguida, reequilibre a coluna em um mililitro por minuto com 12,5% de Buffer B para cinco volumes de coluna. Abra o método criado e aguarde a etapa de eluição.
Colete as frações usando um coletor de frações. Além disso, colete uma alíquota do fluxo e armazene as frações a menos 20 graus Celsius. Avalie o cromatograma salvo automaticamente de todas as etapas de purificação.
Incluindo o perfil de eluição. Após a conclusão, mude as entradas das soluções tampão para água ultrapura e lave a coluna a um mililitro por minuto para cinco volumes de coluna. Restaurando a coluna, mude as entradas de água ultrapura para 20% de etanol e lave a coluna por cinco volumes de coluna.
Para concentrar rAAVs, carregue as frações FPLC desejadas em uma unidade de filtro centrífugo de 15 mililitros com um corte de peso molecular de 100 kilodalton. Centrifugar a 2 000 g durante dois minutos à temperatura ambiente para atingir um volume concentrado de cerca de 500 microlitros. Continue com a troca de tampão adicionando um mililitro de PBS estéril à unidade de filtro centrífugo.
Lave o filtro pipetando. E centrifugue em intervalos de um minuto até atingir um volume de 500 microlitros. Concentre ainda mais os rAAVs transferindo esta amostra de 500 microlitros para uma unidade de filtro centrífugo de 0,5 mililitro com um corte de 100 kilodalton.
E centrifugação a 6.000 G por intervalos de um minuto até que o volume seja inferior a 100 microlitros. Recupere o rAAV concentrado invertendo o dispositivo de filtro em um novo tubo de microcentrífuga e centrifugando para transferir os rAAVs para o tubo. Alicote os rAAVs em tubos de microcentrífuga de baixa retenção e armazene a 80 graus Celsius negativos.
A pureza das preparações de rAAV foi analisada usando a página SDS, revelando bandas distintas da proteína do capsídeo. A visualização de partículas virais por MET mostrou partículas vazias com um centro denso de elétrons e partículas completas. A avaliação das propriedades de impurezas físicas dos rAAVs usando a plataforma de atordoamento revelou partículas intactas do capsídeo em torno de 30 nanômetros, título geral do capsídeo, proteína livre e agregada e DNA de fita simples.
Os ensaios de infectividade em células neuro 2a mostraram altos níveis de infectividade. Culturas neuronais primárias infectadas com as preparações virais demonstradas. propriedades de transferência de genes preservadas.
A transdução in vivo do cerebelo de camundongos com vetores rAAV resultou em expressão prolongada de GFP. Indicando expressão transgênica bem-sucedida no cérebro de mamíferos.
