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Bioengineering

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Passagem e maturação de organoides intestinais humanos para pesquisa de desenvolvimento de medicamentos

Transcrição

Para começar, pipete de um a dois mililitros de solução de enxágue antiaderente para um tubo cônico de 15 mililitros. Gire o tubo para revestir sua superfície. Em seguida, pipete cinco mililitros de solução de DPBS no tubo após remover a solução antiaderente.

Tampe os tubos revestidos até que seja necessário. Pipetar qualquer meio numa placa contendo as cúpulas organoides intestinais humanas. Com uma pipeta de um mililitro, adicione um mililitro de meio DMEM/F-12 frio diretamente à cúpula para separá-la da placa.

Pipete mais um mililitro do meio para colher os organoides restantes. Transfira a suspensão para os tubos cônicos revestidos de 15 mililitros. Pipetar a suspensão para cima e para baixo para desintegrar os organoides até que seja criada uma suspensão de fragmentos uniforme com o tamanho de organoide desejado.

Em seguida, pipetar uma alíquota da suspensão para contagem. Coloque a suspensão restante no gelo. Desenhe uma grade XY na parte inferior de cada poço de uma placa de fundo plano de 96 poços.

Pipetar 50 microlitros de DPBS nos poços. Transfira cinco microlitros da alíquota para cada poço. Conte manualmente o número total de organoides com 50 a 200 micrômetros de diâmetro.

Em seguida, use a equação fornecida para calcular o volume da suspensão organoide. Depois de contar os organoides, remover o sobrenadante e a camada turva do tubo que contém a suspensão restante da touceira. Em seguida, pipete dois mililitros de DMEM/F-12 frio diretamente sobre o pellet.

Centrifugar a suspensão a 200 g durante cinco minutos à temperatura ambiente. Para um sistema derivado de animais, adicione 40 microlitros de um pellet organoide de matriz de origem animal frio. Pipete os organoides para cima e para baixo para distribuí-los na matriz.

Transfira suavemente a mistura organoide da matriz para o centro de uma placa de cultura de tecidos estéril e pré-aquecida de 24 poços. Incube a placa a 37 graus Celsius por 30 minutos para garantir a gelificação da cúpula. Em seguida, pipete 0,5 mililitros de meio de crescimento organoide intestinal quente para as laterais do poço sem perturbar a cúpula antes da incubação.

Para o sistema organoide livre de xeno da matriz quatro, adicione 50 microlitros de meio de crescimento organoide 3X ao pellet esferóide. Em seguida, pipete 100 microlitros da matriz selecionada quatro organoides livres de xeno para a suspensão. Adicione 40 microlitros da mistura organoide de hidrogel ao centro de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços.

Incube a placa a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após a incubação, pipete 0,5 mililitros de meio de crescimento organoide ao longo das laterais do poço. Em seguida, incube a placa novamente a 37 graus Celsius sob 5% de suplementação de dióxido de carbono e 95% de umidade.

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