Para começar, recupere dois tubos de criopreservação contendo células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo humano congelado na passagem três do nitrogênio líquido. Agite-os em banho-maria a 37 graus Celsius até que estejam totalmente descongelados. Em seguida, desinfete os tubos com álcool 75%.
Coloque os tubos desinfetados em uma mesa ultralimpa. Usando uma pipeta, aspire a suspensão celular e transfira-a para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Centrifugue o tubo em uma centrífuga de baixa velocidade a 250 G e quatro graus Celsius por cinco minutos.
Enquanto isso, prepare quatro pratos de cultura de 10 centímetros e adicione nove mililitros de meio a cada prato. Marque o nome, o tipo de célula, a geração e a data do experimento em cada prato. Em seguida, pré-aqueça-os em uma incubadora de células termostáticas de 37 graus Celsius.
Terminada a centrifugação de cinco minutos, desinfete o tubo da centrífuga antes de movê-lo para uma mesa ultralimpa. Usando uma pipeta, remova o sobrenadante e adicione quatro mililitros de meio para atingir a concentração celular desejada. Agite suavemente a solução até que esteja uniformemente dispersa.
Em seguida, adicione um mililitro de suspensão celular a cada prato pré-aquecido e agite-o agitando o mesmo em uma superfície nivelada em um padrão cruzado. Observe as células com ampliação de 40x sob um microscópio óptico antes de colocar os pratos na incubadora de 37 graus Celsius. No segundo dia, observe o estado da célula sob o microscópio óptico com ampliação de 40x antes de prosseguir com a preparação do meio de troca.
Após a desinfecção, transfira as placas de cultura para uma mesa ultralimpa com Nível de Biossegurança 2. Remova o meio de cada placa de cultura. Lave o prato suavemente com dois mililitros de solução PBS duas vezes e adicione 10 mililitros de meio a cada prato.
Transfira as células para a incubadora até que estejam prontas para a coleta do sobrenadante.
