Para começar, colete o sobrenadante da cultura de células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo humano assim que as células estiverem 80% confluentes. Recolher cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e transferi-lo para um tubo de centrifugação de 50 ml. Centrifugue o tubo a 300 x g por 10 minutos em temperatura ambiente para remover as células suspensas e, em seguida, use uma pipeta para coletar o sobrenadante sem perturbar o pellet.
Centrifugue o sobrenadante a 2000 x g durante 10 minutos a quatro graus Celsius para remover os detritos celulares. Colete o sobrenadante resultante com uma pipeta e filtre-o através de uma membrana de 0,22 mícron para remover partículas grandes e detritos celulares. Submeter o filtrado a uma ultracentrifugação a 10 000 x g durante 30 minutos a quatro graus Celsius.
Em seguida, execute uma centrifugação final a 100.000 x g por 70 minutos a quatro graus Celsius. Usando uma pipeta, remova o sobrenadante sem coletar o pellet. Ressuspender o pellet em PBS antes de centrifugar o tubo a 100 000 x g durante 70 minutos a quatro graus Celsius.
Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet obtido de vesículas extracelulares, ou EVs, em um mililitro de PBS. Por fim, transfira a suspensão EV para um tubo de centrífuga de um mililitro e armazene-o a quatro graus Celsius até uma análise mais aprofundada. A microscopia eletrônica de transmissão revelou claramente a estrutura em forma de copo dos EVs com uma membrana de bicamada.
A análise de rastreamento de nanopartículas indicou que elas têm uma distribuição de tamanho de partícula de cerca de 50 a 150 nanômetros. A análise de Western blot mostrou que as proteínas marcadoras características das EVs foram expressas suavemente.
