Este trabalho foi parcialmente apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82202473).

A visão geral das etapas do protocolo é mostrada na Figura 1. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados no estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação de mídia
<ol><li>Prepare um meio de cultura para ADSC sem exossomos usando 450 mL de meio de cultura basal, 50 mL de soro fetal bovino sem exossomos e 5 mL de antibióticos triplos.</li>
</ol>2. Ressuscitação e cultura de ADSCs
NOTA: Ressuscite ADSCs.
<ol><li>Ligue a radiação UV da mesa ultralimpa com antecedência e desinfete-a por 30 min.</li>
	<li>Pré-aqueça o meio em banho-maria a 37 °C previamente.</li>
	<li>Recupere 2 tubos de ADSCs congelados (P3) do nitrogênio líquido e agite-os em banho-maria a 37 °C com temperatura constante até que estejam totalmente descongelados. NOTA: A abertura do tubo do freezer não deve estar em contato com a água para evitar contaminação.</li>
	<li>Desinfete o tubo de criopreservação com álcool 75% e depois mova-o para a mesa ultralimpa. Aspirar a suspensão celular com uma pipeta e colocá-la num tubo de centrifugação de 15 ml.</li>
	<li>Coloque o tubo de centrífuga em uma centrífuga de baixa velocidade e centrifugue a 250 x g por 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Prepare quatro placas de cultura de 10 cm e coloque 9 mL de meio em cada prato. Marque o nome, o tipo de célula, a geração e a data experimental e, em seguida, pré-aqueça-os em uma incubadora termostática de células a 37 °C.</li>
	<li>Desinfete o tubo da centrífuga e mova-o para a mesa ultralimpa. Remova o sobrenadante com uma pipeta.</li>
	<li>Adicione 4 mL de meio e agite suavemente a solução (1 x 105 células / mL) até que esteja uniformemente dispersa. NOTA: Tome cuidado para não eliminar o pellet celular ao extrair o sobrenadante.</li>
	<li>Adicione 1 mL de suspensão celular a cada placa. Agite a louça com um método cruzado. NOTA: Posicione a placa em uma superfície nivelada e agite-a em um padrão cruzado (movendo-a para cima, para baixo, para a esquerda e para a direita) por 5-6 repetições. Evite movimentos circulares, pois eles podem causar acúmulo de células no centro.</li>
	<li>Observe as células com ampliação de 40x com o microscópio óptico e, em seguida, coloque os pratos na incubadora. NOTA: O objetivo principal da observação das células é determinar se elas estão distribuídas uniformemente, pois a distribuição desigual afetará o crescimento subsequente.</li>
	<li>Prepare o meio de troca para as células.<ol><li>Ligue a radiação UV da mesa ultralimpa com antecedência e desinfete-a por 30 min.</li>
		<li>Pré-aqueça o meio em banho-maria a 37 °C previamente.</li>
		<li>Observe o estado da célula sob o microscópio óptico com ampliação de 40x. O nível de confluência é de aproximadamente 50%. NOTA: O nível de confluência é calculado como a razão entre a área ocupada pelas células e a área da superfície da placa de Petri depois que as células aderem à parede e se esticam totalmente.</li>
		<li>Transfira a placa de cultura para a mesa ultralimpa (nível de biossegurança 2) após a desinfecção e remova o meio.</li>
		<li>Enxágue cada placa de cultura duas vezes com 2 mL de solução de PBS suavemente.</li>
		<li>Adicione 10 mL de meio a cada prato. Transfira os pratos para a incubadora.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Coletando o sobrenadante ADSCs e extraindo os EVs
<ol><li>Ligue a radiação UV da mesa ultralimpa com antecedência e desinfete-a por 30 min.</li>
	<li>Observe o estado da célula ao microscópio. O nível de confluência é de aproximadamente 80%.</li>
	<li>Transfira o prato para a mesa ultralimpa após a desinfecção. Recolha cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e coloque-o num tubo de centrifugação de 50 ml. NOTA: As células podem ser congeladas ou descartadas. Se a esterilidade não for necessária, as etapas a seguir podem ser executadas na mesa de operação. Neste ponto, o experimento pode ser pausado e reiniciado mais tarde. Se a experiência for interrompida, conservar o sobrenadante num frigorífico a 4 °C durante uma semana não superior a uma semana. O armazenamento de longo prazo não é recomendado, pois pode afetar a atividade dos VEs. A abordagem ideal é extrair EVs imediatamente.</li>
	<li>Centrifugue (300 x g, 10 min, à temperatura ambiente) para remover as células em suspensão. Recolher o sobrenadante com uma pipeta. NOTA: Não despeje. Deixe um pouco de sobrenadante para evitar que o pellet seja sugado.</li>
	<li>Centrifugar para remover os detritos celulares (2000 x g, 10 min, 4 °C) e, em seguida, continuar a recolher o sobrenadante com uma pipeta. NOTA: Os pontos-chave são os mesmos da etapa 3.4.</li>
	<li>Filtre o sobrenadante com uma membrana de 0,22 um para remover partículas grandes e detritos celulares. NOTA: Filtre o sobrenadante com 2 mL de PBS estéril para umedecer a membrana do filtro antes da filtração.</li>
	<li>Centrifugue na máquina de ultracentrífuga (10.000 x g, 30 min, 4 °C).</li>
	<li>Em seguida, centrifugue a 1,00,000 x g durante 70 min a 4 °C para remover o pellet e recolher o sobrenadante. NOTA: Os EVs obtidos foram purificados por centrifugação várias vezes para aumentar sua pureza. O pellet pode não ser visível a olho nu. Portanto, é crucial operar a pipeta suavemente e deixar um pouco de sobrenadante no fundo para evitar a coleta de pellets.</li>
	<li>Remova o sobrenadante com uma pipeta. Ressuspender o pellet com PBS e centrifugar (1,00,000 x g, 70 min, 4 °C). NOTA: O pellet pode não ser visível a olho nu. Portanto, ao aspirar o sobrenadante com uma pipeta, é fundamental removê-lo de forma suave e completa para maximizar a pureza dos EVs.</li>
	<li>Remova o sobrenadante e obtenha o pellet EVs. Ressuspenda-o com 1 mL de PBS, transfira-o para um tubo de centrífuga de 1 mL e guarde-o em um refrigerador a 4 ° C para detecção subsequente. NOTA: O pellet pode não ser visível a olho nu. Consequentemente, ao aspirar o sobrenadante com uma pipeta, é crucial remover suave e completamente o sobrenadante para maximizar a pureza dos EVs. Se as amostras não forem necessárias por um longo período, armazene-as em uma geladeira a -80 °C.</li>
</ol>

Isolamento baseado em ultracentrífuga de vesículas extracelulares de ADSCs humanas

<ol>
	<li>Al-Ghadban, S., Artiles, M., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+stem+cells+in+regenerative+medicine:+Looking+forward.">Adipose stem cells in regenerative medicine: Looking forward.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 837464 (2021).</li><li>Xin, H., Li, Y., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes/miRNAs+as+mediating+cell-based+therapy+of+stroke.">Exosomes/miRNAs as mediating cell-based therapy of stroke.</a> Front Cell Neurosci. 8, 377 (2014).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tissue+origin+effect+of+extracellular+vesicles+on+cartilage+and+bone+regeneration.">The tissue origin effect of extracellular vesicles on cartilage and bone regeneration.</a> Acta Biomater. 125, 253-266 (2021).</li><li>Gao, X., Salomon, C., Freeman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+adipose+tissue-a+potential+role+in+obesity+and+type+2+diabetes.">Extracellular vesicles from adipose tissue-a potential role in obesity and type 2 diabetes.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 8, 202 (2017).</li><li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+biological+effects+of+extracellular+vesicles+from+adipose-derived+stem+cells+were+markedly+increased+by+low-intensity+ultrasound+stimulation+for+promoting+diabetic+wound+healing).">Production and biological effects of extracellular vesicles from adipose-derived stem cells were markedly increased by low-intensity ultrasound stimulation for promoting diabetic wound healing).</a> Stem Cell Rev Rep. 19 (3), 784-806 (2023).</li><li>Mou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+human+adipose-derived+stem+cells+for+the+improvement+of+angiogenesis+and+fat-grafting+application.">Extracellular vesicles from human adipose-derived stem cells for the improvement of angiogenesis and fat-grafting application.</a> Plast Reconstr Surg. 144 (4), 869-880 (2019).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+bone+immobilized+with+human+adipose+stem+cells-derived+exosomes+promotes+bone+regeneration.">Tissue-engineered bone immobilized with human adipose stem cells-derived exosomes promotes bone regeneration.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 10 (6), 5240-5254 (2018).</li><li>Han, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cell-derived+extracellular+vesicles+inhibit+the+fibrosis+of+fibrotic+buccal+mucosal+fibroblasts+via+the+microRNA-375/foxf1+axis.">Adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicles inhibit the fibrosis of fibrotic buccal mucosal fibroblasts via the microRNA-375/foxf1 axis.</a> Stem Cells Int. 2021, 9964159 (2021).</li><li>Brezgin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technological+aspects+of+manufacturing+and+analytical+control+of+biological+nanoparticles.">Technological aspects of manufacturing and analytical control of biological nanoparticles.</a> Biotechnol Adv. 64, 108122 (2023).</li><li>Kim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Character+comparison+of+abdomen-derived+and+eyelid-derived+mesenchymal+stem+cells.">Character comparison of abdomen-derived and eyelid-derived mesenchymal stem cells.</a> Cell Prolif. 46 (3), 291-299 (2013).</li><li>Gan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+improve+liver+fibrosis+by+regulating+the+miR-20a-5p/TGFBR2+axis+to+affect+the+p38+MAPK/NF-&#954;B+pathway.">Exosomes from adipose-derived mesenchymal stem cells improve liver fibrosis by regulating the miR-20a-5p/TGFBR2 axis to affect the p38 MAPK/NF-&#954;B pathway.</a> Cytokine. 172, 156386 (2023).</li><li>Jung, M. K., Mun, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+and+imaging+of+exosomes+by+transmission+electron+microscopy.">Sample preparation and imaging of exosomes by transmission electron microscopy.</a> J Vis Exp. (131), e56482 (2018).</li><li>Han, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-transplantation+of+exosomes+derived+from+hypoxia-preconditioned+adipose+mesenchymal+stem+cells+promotes+neovascularization+and+graft+survival+in+fat+grafting.">Co-transplantation of exosomes derived from hypoxia-preconditioned adipose mesenchymal stem cells promotes neovascularization and graft survival in fat grafting.</a> Biochem Biophys Res Commun. 497 (1), 305-312 (2018).</li><li>Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+centrifugation+induces+aggregation+of+extracellular+vesicles.">High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 4, 29509 (2015).</li><li>Lamparski, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+characterization+of+clinical+grade+exosomes+derived+from+dendritic+cells.">Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells.</a> J Immunol Methods. 270 (2), 211-226 (2002).</li><li>Baranyai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+exosomes+from+blood+plasma:+Qualitative+and+quantitative+comparison+of+ultracentrifugation+and+size+exclusion+chromatography+methods.">Isolation of exosomes from blood plasma: Qualitative and quantitative comparison of ultracentrifugation and size exclusion chromatography methods.</a> PLoS One. 10 (12), e0145686 (2015).</li><li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+extracellular+vesicles+by+three-dimensional+dynamic+culture+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Engineering extracellular vesicles by three-dimensional dynamic culture of human mesenchymal stem cells.</a> J Extracell Vesicles. 11 (6), e12235 (2022).</li><li>Eguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+with+cancer+stem+cell-like+properties+secrete+exosomes+and+HSP90+in+a+3D+nanoenvironment.">Organoids with cancer stem cell-like properties secrete exosomes and HSP90 in a 3D nanoenvironment.</a> PLoS One. 13 (2), e0191109 (2018).</li></ol>

Os autores não têm interesse financeiro a declarar.

Durante o processo experimental formal, vários pontos são cruciais para alcançar os melhores resultados experimentais. Com base em nossa experiência anterior, recomenda-se optar pela passagem 3-6 ADSCs, pois garantem o melhor estado celular possível. Antes do P3, os glóbulos vermelhos, as células endoteliais e outras células diversas podem não ter sido excluídos. Após P6, as células podem envelhecer gradualmente, o que pode afetar o estado dos EVs secretados. Em segundo lugar, o sobrenadante deve ser coletado...

A maioria das ADSCs é derivada do tecido adiposo e demonstrou promover a regeneração e reconstrução de vários tecidos e órgãos, incluindo miocárdio, osso e pele1. Pesquisas recentes sugerem que a função regenerativa das ADSCs pode ser devida ao contato intercelular e aos efeitos parácrinos das células2. O efeito parácrino é um meio importante para as células interagirem e transferirem informações em curtas distâncias, e essa função é alcançada por meio de vesículas extracelulares (EVs).
Os EVs são estruturas de membrana de camada dupla produzidas pelas células, com um diâmetro variando de 40 nm a 160 nm (com uma média de cerca de 100 nm). Eles afetam diferentes funções celulares, como produção de citocinas, proliferação celular, apoptose e metabolismo 3,4. Numerosos estudos foram realizados sobre as funções dos ADSC EVs, incluindo a promoção da regeneração óssea, regeneração do tecido da mucosa oral, sobrevivência do tecido adiposo após o transplante de tecido e reparo de feridas cutâneas 5,6,7,8. O enorme potencial dos ADSC EVs na medicina regenerativa é evidente. Existem vários métodos para extrair e separar EVs do sobrenadante, como técnicas baseadas em centrifugação, precipitação, tamanho molecular, afinidade e microfluídica. O método de ultracentrifugação é amplamente considerado o padrão-ouro para isolar EVs9. O princípio fundamental da ultracentrifugação para separação de EV baseia-se no fato de que as partículas na amostra têm coeficientes de sedimentação variados, resultando em sua sedimentação e agregação em camadas de separação distintas. No entanto, um protocolo detalhado enfatizando as precauções durante a ultracentrifugação ainda não foi estabelecido.
Portanto, este estudo descreve objetivamente a cultura ADSC, a coleta de sobrenadantes e os procedimentos de ultracentrifugação de EVs e pontos-chave com um fluxo lógico de informações e linguagem clara e formal. Isso fornece uma referência valiosa para experimentos futuros.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrodisc Needle Filter of Supor Membrane</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>4652</td>
			<td>0.22 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basal Medium For Cell Culture</td>
			<td>OriCell</td>
			<td>BHDM-03011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Without EXO + Culture Supplement (For Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells)</td>
			<td>OriCell</td>
			<td>HUXMD-05002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>Lx70-S8F2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Speed Centrifuge</td>
			<td>Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co.,Ltd.</td>
			<td>SC-3612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-nr-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima Max-XP Tabletop Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Gentamicin Solution (100x)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1410</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and characterization of extracellular vesicles from human adipose-derived mesenchymal stem cells

As células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo humano (ADSCs) podem promover a regeneração e reconstrução de vários tecidos e órgãos. Pesquisas recentes sugerem que sua função regenerativa pode ser atribuída ao contato célula-célula e aos efeitos parácrinos celulares. O efeito parácrino é uma forma importante de as células interagirem e transferirem informações em curtas distâncias, nas quais as vesículas extracelulares (EVs) desempenham um papel funcional como transportadoras. Existe um potencial significativo para ADSC EVs em medicina regenerativa. Vários estudos relataram a eficácia desses métodos. Vários métodos para extrair e isolar EVs são atualmente descritos com base em princípios como centrifugação, precipitação, tamanho molecular, afinidade e microfluídica. A ultracentrifugação é considerada o padrão-ouro para isolar EVs. No entanto, ainda não existe um protocolo meticuloso para destacar as precauções durante a ultracentrifugação. Este estudo apresenta a metodologia e as etapas cruciais envolvidas na cultura de ADSC, coleta de sobrenadante e ultracentrifugação EV. No entanto, embora a ultracentrifugação seja econômica e não exija tratamento adicional, ainda existem algumas desvantagens inevitáveis, como baixa taxa de recuperação e agregação de EV.

Most ADSCs are derived from adipose tissue and have been demonstrated to promote the regeneration and reconstruction of various tissues and organs, including the myocardium, bone, and skin1. Recent research suggests that the regenerative function of ADSCs may be due to intercellular contact and the paracrine effects of the cells2. The paracrine effect is an important means for cells to interact and transfer information over short distances, and this function is achieved through extracellular vesicles (EVs).
EVs are double-layer membrane structures produced by cells, with a diameter ranging from 40 nm to 160 nm (with an average of about 100 nm). They affect different cellular functions, such as cytokine production, cell proliferation, apoptosis, and metabolism3,4. Numerous studies have been conducted on the functions of ADSC EVs, including promoting bone regeneration, oral mucosal tissue regeneration, adipose tissue survival after tissue transplantation, and skin wound repair5,6,7,8. The enormous potential of ADSC EVs in regenerative medicine is evident. Various methods exist for extracting and separating EVs from the supernatant, such as techniques based on centrifugation, precipitation, molecular size, affinity, and microfluidics. The ultracentrifugation method is widely considered the gold standard for isolating EVs9. The fundamental principle of ultracentrifugation for EV separation is based on the fact that particles in the sample have varying sedimentation coefficients, resulting in their sedimentation and aggregation in distinct separation layers. Nevertheless, a detailed protocol emphasizing precautions during ultracentrifugation has not yet been established.
Therefore, this study objectively outlines the ADSC culture, supernatant collection, and EVs ultracentrifugation procedures and key points with a logical flow of information and clear, formal language. This provides a valuable reference for future experiments.

Autor em destaque: Padronizando e melhorando a extração e purificação de vesículas extracelulares de ADSCs humanas

Purificação e Caracterização de Vesículas Extracelulares de Células-Tronco Mesenquimais Derivadas de Tecido Adiposo Humano

Our research focuses on the preparation and purification of extracellular vesicles from human adipose-derived mesenchymal stem cells. The problem we want to solve is how to standardize this process and improve the purification efficiency. Currently, there are many technologies used to extract extracellular vesicles, such as ultracentrifugation, ultrafiltration, volume exclusion chromatography, polymer precipitation, immunoaffinity capture, microfluidic technology, and so on.However, ultracentrifugation is recognized as a gold standard, admittedly. In the future, we will focus on the application of extracellular vesicles as vectors, including carrying MRNA, plasmids, and other small molecules and transfecting them into cells.

Primeiramente, as ADSCs foram caracterizadas e identificadas, incluindo sua morfologia10 e anticorpos de superfície. Com base na Figura 2A, é evidente que as ADSCs estão dispostas em forma de fuso e formam um vórtice após um crescimento denso. As células cultivadas foram diferenciadas em células adipogênicas, osteogênicas e condrogênicas e coradas com Oil Red O, Alizarin Red e AlcianBlue 11. O experimento de diferenciação induzida e...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Standardizing and Improving the Extraction and Purification of Extracellular Vesicles from Human ADSCs at JoVE.com

Este protocolo descreve todos os procedimentos, desde a cultura de células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo humano (ADSCs) e coleta de sobrenadante até a extração de vesículas extracelulares (EVs) usando ultracentrifugação.

Human adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) can promote the regeneration and reconstruction of various tissues and organs. Recent research ...

Nossa pesquisa se concentra na preparação e purificação de vesículas extracelulares de células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo humano. O problema que queremos resolver é como padronizar esse processo e melhorar a eficiência da purificação. Atualmente, existem muitas tecnologias usadas para extrair vesículas extracelulares, como ultracentrifugação, ultrafiltração, cromatografia de exclusão de volume, precipitação de polímeros, captura de imunoafinidade, tecnologia microfluídica e assim por diante.No entanto, a ultracentrifugação é reconhecida como um padrão-ouro, reconhecidamente. No futuro, vamos nos concentrar na aplicação de vesículas extracelulares como vetores, incluindo o transporte de MRNA, plasmídeos e outras pequenas moléculas e a transfecção em células.

purification-characterization-extracellular-vesicles-from-human

Research

JoVE Journal

Medicine

Purification and Characterization of Extracellular Vesicles from Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells

392 visualizações.  Chinese PLA General Hospital. Nossa pesquisa se concentra na preparação e purificação de vesículas extracelulares de células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo humano. O problema que queremos resolver é como padronizar esse processo e melhorar a eficiência da purificação. Atualmente, existem muitas tecnologias usadas para extrair vesículas extracelulares, como ultracentrifugação, ultrafiltração, cromatografia de exclusão de volume, precipitação de polímeros, captura de imunoafinidade, tecno...

Vídeo: Autor em destaque: Padronizando e melhorando a extração e purificação de vesículas extracelulares de ADSCs humanas

Human adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) can promote the regeneration and reconstruction of various tissues and organs. Recent research suggests that their regenerative function may be attributed to cell-cell contact and cell paracrine effects. The paracrine effect is an important way for cells to interact and transfer information over short distances, in which extracellular vesicles (EVs) play a functional role as carriers. There is significant potential for ADSC EVs in regenerative medicine. Multiple studies have reported on the effectiveness of these methods. Various methods for extracting and isolating EVs are currently described based on principles such as centrifugation, precipitation, molecular size, affinity, and microfluidics. Ultracentrifugation is regarded as the gold standard for isolating EVs. Nevertheless, a meticulous protocol to highlight precautions during ultracentrifugation is still absent. This study presents the methodology and crucial steps involved in ADSC culture, supernatant collection, and EV ultracentrifugation. However, even though ultracentrifugation is cost-effective and requires no further treatment, there are still some inevitable drawbacks, such as a low recovery rate and EV aggregation.

This protocol describes all procedures, from culturing human adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) and collecting supernatant to extracting extracellular vesicles (EVs) using ultracentrifugation.

Medicina

Resuscitation and Culture of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells (ADSCs) for Extracellular Vesicle Extraction

To begin, retrieve two cryopreservation tubes containing frozen human adipose-derived mesenchymal stem cells at passage three from liquid nitrogen. Agitate them in a 37 degree Celsius water bath until fully thawed. Then disinfect the tubes using 75%alcohol.Place the disinfected tubes on an ultra-clean table. Using a pipette, aspirate the cell suspension and transfer it to a 15 milliliter centrifuge tube. Centrifuge the tube in a low speed centrifuge at 250 G and four degrees Celsius for five minutes.Meanwhile, prepare four 10-centimeter culture dishes and add nine milliliters of medium to each dish. Mark the name, cell type, generation, and the experiment date on each dish. Then preheat them in a 37 degree Celsius thermostatic cell incubator.Once the five minute centrifugation is over, disinfect the centrifuge tube before moving it to an ultra-clean table. Using a pipette, remove the supernatant and add four milliliters of medium to achieve the desired cell concentration. Gently agitate the solution until it is evenly dispersed.Next, add one milliliter of cell suspension to each preheated dish and shake it by agitating the same on a level surface in a cross pattern. Observe the cells at 40x magnification under an optical microscope before placing the dishes into the 37 degree Celsius incubator. On day two, observe the cell state under the optical microscope at 40x magnification before proceeding for exchange medium preparation.After disinfection, transfer the culture dishes to an ultra-clean table with Biosafety Level 2. Remove the medium from each culture dish. Rinse the dish gently with two milliliters of PBS solution twice and add 10 milliliters of medium to each dish.Transfer the cells to the incubator until they're ready for supernatant collection.

Ressuscitação e Cultura de Células-Tronco Mesenquimais Derivadas de Tecido Adiposo (ADSCs) para Extração de Vesícula Extracelular

Extracting Extracellular Vesicles (EVs) from Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cell Culture

To begin, collect the supernatant from the human adipose-derived mesenchymal stem cell culture once the cells are 80%confluent. Collect the supernatant carefully using a pipette and transfer it to a 50 milliliter centrifuge tube. Centrifuge the tube at 300 x g for 10 minutes at room temperature to remove suspended cells, then use a pipette to collect the supernatant without disturbing the pellet.Centrifuge the supernatant at 2000 x g for 10 minutes at four degrees Celsius to remove cellular debris. Collect the resultant supernatant with a pipette and filter it through a 0.22 micron membrane to remove large particles and cell debris. Subject the filtrate to ultra centrifugation at 10, 000 x g for 30 minutes at four degrees Celsius.Then perform a final centrifugation at 100, 000 x g for 70 minutes at four degrees Celsius. Using a pipette, remove the supernatant without collecting the pellet. Resuspend the pellet in PBS before centrifuging the tube at 100, 000 x g for 70 minutes at four degrees Celsius.Remove the supernatant and resuspend the obtained pellet of extracellular vesicles, or EVs, in one milliliter of PBS. Finally, transfer the EV suspension to a one milliliter centrifuge tube and store it at four degrees Celsius until further analysis. Transmission electron microscopy clearly revealed the cup-shaped structure of the EVs with a bilayer membrane.Nanoparticle tracking analysis indicated that they have a particle size distribution of around 50 to 150 nanometers. Western blot analysis showed that the characteristic marker proteins of EVs were expressed smoothly.