Isolamento de Frações Mitocondriais Enriquecidas de Culturas de Células e Amostras de Tecidos de Pequenos Animais para Ensaios de Atividade em Gel

Para começar, ressuspenda o grânulo de células compactadas em um volume de tampão hipotônico igual a sete vezes o volume do grânulo celular. Transfira a suspensão celular para um homogeneizador Potter-Dounce e incube no gelo por dois minutos, permitindo que as células inchem. Quebre as membranas celulares realizando de 8 a 10 golpes no homogeneizador acoplado a um pilão de Teflon acionado por motor girando a 600 RPM.

Adicione um volume igual de tampão hipertônico à suspensão celular para gerar um ambiente isotônico. Transferir o homogeneizado para um tubo de 10 a 15 mililitros. Centrifugue a 1.000 g por cinco minutos a quatro graus Celsius e colete o sobrenadante em um tubo de polipropileno de 1,5 mililitro.

Para coletar a fração bruta mitocondrial, centrifugue em uma microcentrífuga a 16.000G por dois minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet enriquecido com mitocôndrias com 0,5 mililitros de tampão A. Combine o conteúdo de dois tubos em um e centrifugue conforme demonstrado anteriormente. Após a última centrifugação, ressuspender o pellet em 300 microlitros de tampão A. Quantificar a concentração de proteína mitocondrial usando o ensaio de Bradford.

Usando uma tesoura, corte os 20 a 30 miligramas de tecido animal. Lave o tecido três a quatro vezes em tampão de homogeneização com a ajuda de um coador, tomando cuidado para não perder os pedaços menores. Transfira os pedaços de tecido com tampão para o homogeneizador.

Para tecidos hepáticos, baço e rins, execute quatro a seis movimentos para cima e para baixo no LVM Potter com um pilão de Teflon acionado por motor a 600 RPM.