Comece ressuspendendo as frações mitocondriais obtidas de culturas de células ou tecidos de mamíferos em tampão de amostra nativo azul para obter uma concentração de proteína de cerca de 10 miligramas por mililitro. Para solubilizar as membranas mitocondriais, adicione digitonina para obter uma proporção de quatro gramas de digitonina por grama de proteína mitocondrial. Misture por pipetagem suave e incube no gelo por cinco minutos.
Centrifugar a suspensão numa microcentrífuga a 20 000 g durante 25 minutos a quatro graus Celsius para remover as matérias insolúveis. Colete o sobrenadante em um tubo novo, adicione 5% de azul de Coomassie G-250, equivalente a um terço do volume inicial de ressuspensão, e misture por pipetagem. Adicione o tampão do cátodo frio A na câmara superior do aparelho de eletroforese e o tampão do ânodo na câmara inferior.
Carregue 30 a 100 microgramas de proteína mitocondrial nos poços em um gel de poliacrilamida. Após a eletroforese, coloque o gel em uma caixa de plástico. Adicione volume suficiente de solução de ensaio de atividade de gel apropriada para cobrir o gel e incube à temperatura ambiente com agitação suave, protegendo da luz.
Quando as bandas apropriadas tiverem se desenvolvido, remova a solução de ensaio. Lave o gel duas vezes com água destilada antes de fixá-lo com 40% de metanol e 10% de ácido acético por 30 minutos. A análise do ensaio de atividade em gel revelou padrões distintos de montagem de supercomplexos em camundongos e células humanas.
O complexo livre 1 foi observado em células de camundongo, enquanto não foi detectável nas mitocôndrias humanas. Os padrões do complexo 4 foram semelhantes em linhagens celulares humanas, mas variaram em linhagens celulares de camundongos devido a uma variante mutante do SCAF1.
