Para começar, prepare 30 microlitros de tampão de coloração em concentrações de trabalho 2x para controles de cor única e FMO. Transfira a cor única e o tampão de coloração de controle FMO para os poços de uma placa de 96 poços. Complete o volume com 20 microlitros de tampão FACS.
Para corar a amostra, prepare 0,5 mililitros de tampão de coloração 2x FACS em tubos de centrífuga de 1,5 mililitro. Pipete 10 microlitros da suspensão celular para poços de controle de cor única e FMO. Em seguida, adicione 2x tampão de coloração FACS ao resto da suspensão celular e incuba.
Em seguida, adicione 100 microlitros de tampão FACS nos poços e dois mililitros do tampão nos tubos de amostra. Centrifugue a 500G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Aspire o sobrenadante e, em seguida, ressuspenda o sedimento celular no tampão de viabilidade.
Adicione 300 microlitros de meios de proliferação em tubos de centrífuga de 1,5 mililitro. Estes atuarão como tubos de coleta para classificação de células. Depois de classificar as células usando FACS, centrifugue as células coletadas a 800G por 10 minutos a quatro graus Celsius.
Use uma pipeta P1000 para remover cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet. Ressuspender o sedimento em meios de proliferação até uma densidade final de 100 células por microlitro. Semeie a suspensão celular nos poços de uma placa de cultura de tecidos de 48 poços.
Por fim, transfira a placa para uma incubadora a 37 graus Celsius sob a respectiva suplementação de gás até que as células estejam confluentes. Células confluentes com morfologia típica de fibroblastos foram obtidas dentro de cinco dias após o cultivo.
