Este é um protocolo para o isolamento das células-tronco do músculo do camundongo primário para o estudo do metabolismo ex vivo. Este protocolo fornece uma população muito maior de células-tronco em comparação com outros protocolos que tentamos no passado. E o mais importante, uma vez que diferenciamos essas células-tronco em motubes, elas exibem fisiologia normal, então coisas como ritmos circadianos.
Ao tentar este procedimento pela primeira vez, tome notas detalhadas e salve várias imagens porque cada explantação de tecido parece diferente e haverá variação no crescimento dos míobios. Sem demonstração visual, é difícil saber se você está isolando as células corretas. Nós nos beneficiamos da generosa ajuda de outros que nos mostraram este método quando o estabelecemos em nosso laboratório.
Depois de preparar o prato para dissecção de acordo com o manuscrito, prepare uma câmara úmida colocando duas a três folhas de papel absorvente grosso em um saco plástico e use uma pipeta para molhar a superfície do papel com água estéril. Coloque a câmara sob luz UV por cinco minutos para esterilizar. Disseque o músculo desejado de um rato de quatro a oito semanas de idade e enxágue suavemente em PBS contendo 40 microgramas por mililitro de gentamicina para esterilizar.
Use fórceps estéreis para transferir o músculo para uma placa de Petri não revestida de 10 centímetros. Adicione 0,5 a um mililitro de mídia de chapeamento sobre o músculo de tal forma que o tecido esteja úmido, mas não flutuando. Use um bisturi estéril ou lâmina de barbear para cortar suavemente o músculo em pequenos fragmentos.
Use fórceps ou uma pipeta para transferir os fragmentos musculares para a superfície de uma placa pré-revestida de seis centímetros. Sobreponha suavemente 0,8 mililitros adicionais de mídia de revestimento sobre o tecido. Coloque a antena de seis centímetros contendo os fragmentos musculares dentro da câmara úmida e devolva-a a uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 48 horas.
Prepare e pré-aqueça a mídia myoblast, trippsin e PBS-gentamicina em um banho de água a 37 graus Celsius. Para revestir um frasco T25 para cada grupo muscular, adicione dois mililitros de solução de revestimento à superfície do frasco, agite suavemente para criar uma camada uniforme na superfície e incubar o frasco a quatro graus Celsius por uma hora. Agora com uma pipeta, remova a mídia de chapeamento das explanações musculares e enxágue suavemente as explantas musculares com dois mililitros de PBS-gentamicina.
Remova rapidamente o PBS e não deixe a placa sentar no PBS. Em seguida, adicione suavemente um mililitro de PBS-gentamicina e coloque a placa na incubadora Celsius de 37 graus por um minuto. Use uma pipeta P1000 para coletar o PBS com células em um tubo de centrífuga de 15 mililitros.
Em seguida, adicione um mililitro de trippsina à placa e devolva-a à incubadora Celsius de 37 graus por três minutos. Toque suavemente nas placas para desalojar os meus oblablados. Colete o trypsin com células e combine com a coleção PBS.
Adicione oito mililitros de mídia myoblast ao tubo centrífuga e inverta suavemente para misturar. Sobreponha suavemente dois mililitros de solução de revestimento nas placas musculares e devolva as placas à incubadora Celsius de 37 graus. Gire os tubos de centrífuga contendo células em uma centrífuga por três minutos a 200 vezes g.
Aspire o supernasal e mantenha aproximadamente um mililitro no tubo. Adicione suavemente a mídia myoblast, transfira as células para o frasco pré-revestido e coloque o frasco na incubadora Celsius de 37 graus. Aspire a mídia de frascos P0 myoblast T25.
Enxágüe as células brevemente com dois mililitros de PBS-gentamicina quente e aspire o PBS do frasco. Pipeta dois mililitros de PBS quente em cada frasco contendo myoblasts. Coloque os frascos com PBS na incubadora Celsius de 37 graus por três minutos.
Em seguida, toque firmemente o lado do frasco para desalojar as células. Verifique sob um microscópio leve para obter myoblasts livremente flutuantes. Coloque os frascos em pé em uma capa de cultura de tecido e enxágue a parte inferior dos frascos com 10 mililitros de mídia myoblast duas a três vezes para garantir que todas as células sejam desalojadas.
Colete a mistura de mídia celular em um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Centrifugar por três minutos a 200 vezes g. Aspire a mídia para deixar em torno de um mililitro no tubo tendo cuidado para evitar a pelota celular.
Adicione suavemente um volume apropriado de mídia myoblast ao tubo centrífuga e misture suavemente. Distribua a mistura celular para novos frascos T75 seis mililitros cada. Adicione 10 mililitros de mídia myoblast a cada novo frasco T75.
Agite suavemente os frascos horizontalmente para distribuir as células e colocá-las na incubadora a 37 graus Celsius durante a noite. Neste protocolo, as células primárias emergiram das explantas sob um microscópio de luz padrão. As primeiras colheitas de myoblasts apareceram como pequenas esferas redondas e brilhantes.
A diferenciação dos míobios levou de quatro a seis dias durante os quais a morfologia das células mudou de esferas redondas únicas para fibras longas e fundidas. Foram render-se miotubes totalmente diferenciados que estavam prontos para a medição das taxas de consumo de oxigênio. Essas células podem ser usadas para uma série de aplicações a jusante.
Por exemplo, frequentemente os usamos para estudar flauta de substrato em instrumentos de cavalo marinho.
