Para começar, obtenha 250 miligramas de SAT acima do músculo peitoral maior durante o implante do DCEI em solução de armazenamento de tecido de classificação de células ativada magneticamente. Prepare um miligrama por mililitro de colagenase / dispase em 10 mililitros de solução salina balanceada de Hanks fria. Sob um gabinete de fluxo laminar, pique os tecidos em pedaços de um milímetro cúbico em 500 microlitros de solução de colagenase / dispase.
Adicione 4,5 mililitros da solução de colagenase / dispase à mistura e transfira o tecido triturado para um tubo de centrífuga limpo de 50 mililitros. Lave a tampa da placa de Petri com cinco mililitros de solução de colagenase / dispase e adicione-a ao tubo. Incube o tubo por 30 minutos a 37 graus Celsius em um rotador de tubo ajustado para 20 rotações por minuto.
Para interromper a digestão, despeje 10 mililitros de meio de crescimento de células endoteliais completo no tubo. Depois de triturar a mistura digerida com uma cânula Venflon de calibre 14, coe-a através de uma peneira de células de 70 micrômetros e enxágue com 10 mililitros de tampão 0,5% PBS-BSA. Centrifugue o filtrado a 300 g durante 10 minutos à temperatura ambiente e elimine o sobrenadante.
Para remover as células mortas, adicione 200 microlitros de grânulos de remoção de células mortas ao pellet de células tomadas em um tubo de microcentrífuga e incuba. Em seguida, conecte uma coluna de separação de líquido com um filtro de 30 micrômetros ao ímã separador e coloque um tubo de centrífuga de 15 mililitros embaixo. Depois de lavar a coluna com tampão de ligação de remoção de células mortas, adicione a suspensão do cordão de amostra.
Deixe-o passar sob gravidade e colete o eluato. Em seguida, gire o eluato de células vivas coletado e ressuspenda o pellet resultante em 400 microlitros de 0,5% PBS-BSA. Incube as células suspensas com 20 microlitros de esferas magnéticas revestidas com anti-CD31 a quatro graus Celsius por 20 minutos.
Após a centrifugação, ressuspenda o pellet celular em 500 microlitros de 0,5% PBS-BSA. Conecte uma coluna com um filtro de 30 micrômetros ao ímã separador e coloque um tubo de centrífuga de 15 mililitros embaixo. Adicione a suspensão de microesferas de células à coluna e deixe-a passar por gravidade.
Depois de lavar a coluna, coloque-a em um novo tubo de centrífuga de 15 mililitros e adicione um mililitro de 0,5% PBS-BSA à coluna. Empurre o êmbolo da coluna para coletar a fração CD31-positiva. Centrifugue a amostra conforme demonstrado anteriormente e ressuspenda o pellet celular em um mililitro de meio de crescimento de células endoteliais microvasculares completas.
Dispense a suspensão em dois alvéolos de uma placa de 24 poços revestida com gelatina a 2%. Cultive as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por duas a quatro semanas até que as células se tornem quase 80% confluentes.
