Preparando a suspensão unicelular da medula óssea da calvária de camundongos para estudar a resposta imune a distúrbios cerebrais

Para preparar a suspensão unicelular da medula óssea da calvária de camundongos, sob um microscópio de dissecação, retire cuidadosamente a dura-máter do crânio isolado usando uma pinça romba. Coloque a calvária em um prato contendo PBS mantido no gelo e use uma pipeta de um mililitro para enxaguá-la, garantindo a remoção de resíduos de sangue de sua superfície. Transfira a calvária para um novo prato contendo PBS fresco e frio suficiente para mergulhá-lo.

Use uma tesoura estéril para cortar a calvária em fragmentos de aproximadamente três milímetros por três milímetros em PBS frio. Usando uma agulha de calibre 18, faça um furo no fundo de um tubo de microcentrífuga de 500 microlitros. Insira este tubo em um tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitro contendo 20 microlitros de PBS frio.

Em seguida, transfira os fragmentos da calvária para o tubo de 500 microlitros. Centrifugue a configuração a 10.000 g por 30 segundos a quatro graus Celsius. Ressuspenda as células coletadas da medula óssea da calvária em 500 microlitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos e incube em temperatura ambiente por 30 segundos.

Transfira a suspensão para um tubo de centrífuga de 15 mililitros contendo quatro mililitros de PBS frio. Centrifugar a 400 g durante seis minutos a quatro graus Celsius. Lave mais uma vez com cinco mililitros de PBS frio.

Finalmente, ressuspenda o palato celular em um tampão apropriado.