Imuno-histoquímica multiplex para análise do subtipo de células NK uterinas em tecidos endometriais

Para começar, obtenha a seção de tecido endometrial humano em uma lâmina de vidro para imuno-histoquímica multiplex e asse as seções de tecido a 60 graus Celsius por duas horas. Em seguida, mergulhe a lâmina sequencialmente em soluções apropriadas para desparafinação, hidratação e fixação. Adicione 200 mililitros do respectivo tampão AR6 ou AR9 para cada anticorpo a um de recuperação de antígeno resistente ao calor.

Depois de colocar as seções no tampão de recuperação de antígeno, aqueça-as no micro-ondas em alta potência até ferver. Cubra o frouxamente e aqueça em baixa potência por 15 minutos. Depois que a lâmina esfriar, enxágue-a com água bidestilada e, seguida de PBST.

Em seguida, remova o excesso de solução com papel absorvente e desenhe um círculo completo ao redor do tecido com uma caneta barreira hidrofóbica. Em seguida, incube as seções com peróxido de hidrogênio a 3% por oito minutos em temperatura ambiente. Em seguida, aplique uma solução de bloqueio e incube por 10 minutos em temperatura ambiente.

Depois de remover a solução de bloqueio, aplique 150 microlitros do primeiro anticorpo primário, CD49a, em cada lâmina em uma diluição de 1 a 1000 em 1x diluente de anticorpo. Antes de aplicar o anticorpo secundário, remova o excesso de umidade usando papel absorvente. Adicione quatro a cinco gotas do anticorpo secundário 1x anti-rato e peroxidase de raiz-forte de coelho em cada lâmina.

Em seguida, diluir a amplificação do sinal de tiramida ou o corante TSA 1 a 100 vezes no diluente de amplificação. E adicione 150 microlitros desta solução diluída a cada lâmina e incuba. Para eliminar os fluoróforos não ligados, ferva as seções em 200 mililitros de tampão AR6 dentro de um resistente ao calor no micro-ondas por dois minutos.

Em seguida, mude o micro-ondas de alta potência para baixa potência por 15 minutos. Adicione 150 microlitros de solução de trabalho DAPI diluída em PBST gota a gota. Seque as seções inteiramente em uma área escura por aproximadamente 30 minutos.

Aplique uma única gota do montante fluorescente anti-têmpera e coloque cuidadosamente uma lamínula.