Para começar, faça a imagem das seções de tecido endometrial após a coloração com anticorpos apropriados. Para importar imagens multiespectrais, navegue até Arquivo e, em seguida, Abrir imagem na interface do software. Clique em Selecionar fluoróforos e escolha a biblioteca espectral apropriada para desfazer a mistura dos fluoróforos e clique em OK para confirmar.
Isole o espectro de autofluorescência usando a ferramenta conta-gotas AF para amostrar uma área de tecido representativa da imagem AF e rotule os quatro marcadores de superfície celular e atribua cores específicas para identificação. Clique em Preparar imagem ou Preparar tudo para finalizar a preparação. Para segmentação de tecido, delineie manualmente de três a cinco regiões por tipo de tecido, incluindo áreas epiteliais, estromais e em branco.
Ajuste regiões e parâmetros conforme necessário para melhorar o conjunto de dados de treinamento, aumentando a precisão do software na identificação de estruturas de tecido. Em células de segmento, selecione Núcleos e Membrana. Escolha DAPI para identificar núcleos celulares e ajuste a configuração de intensidade para detectar todos os núcleos celulares sem ruído de fundo.
Selecione os sinais CD16, CD49A e CD56 para encontrar a membrana e auxiliar na divisão nuclear. Use o recurso de divisão de componentes nucleares para distinguir núcleos próximos. No esquema de fenotipagem, adote os marcadores CD56, CD49A, CXCR4 e CD16 para fenotipagem celular.
Use o botão Adicionar para categorizar as células como expressando positiva ou negativamente cada marcador. Rotule manualmente pelo menos cinco células para cada fenótipo durante o processo de treinamento. Depois de configurar a fenotipagem celular, o software indicará a expressão de marcadores de superfície para cada célula.
Exporte os dados para uma planilha para análise posterior. A nova estratégia de classificação identificou quatro subtipos de células NK com base na expressão de CD49A e CXCR4.