Para começar, descongele as células epiteliais da superfície ovariana humana criopreservadas. Misture as células com 10 mililitros de meio de lavagem. Depois de centrifugar as células, ressuspenda o pellet em dois mililitros de epitélio da superfície ovariana ou meio OSE 2D e transfira-o para dois poços de uma placa de 12 poços.
Adicione um mililitro de meio OSE 2D extra no poço e cultive a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono por 72 horas antes da primeira renovação do meio. Empregue a coloração Trypan Blue para contar células epiteliais de superfície ovariana humana vivas recém-isoladas ou descongeladas criopreservadas com um contador de células automatizado. Misturar o número desejado de células num mililitro de meio orgânico básico OSE gelado e centrifugar o tubo a 240 G durante cinco minutos.
Usando uma pipeta, ressuspenda o pellet celular em solução de extrato de membrana basal não diluída gelada para obter 10.000 células por 10 microlitros. Adicione gotículas de 10 microlitros de solução de extrato de membrana basal OSE por poço em uma lâmina pré-aquecida com câmara de vários poços e coloque a placa de cabeça para baixo a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono por 15 minutos. Depois que o gel solidificar, adicione 100 microlitros de meio OSE 3D e cultive a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono.
Depois de remover o meio gasto, adicione 100 microlitros de DMEM F12 avançado gelado a cada poço. Raspe o fundo dos poços com uma ponta de pipeta P1000 para destacar as gotículas de gel e transfira cada gota de gel flutuante para um tubo de 1,5 mililitro. Centrifugar o tubo a 240 G durante cinco minutos.
Depois de descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 300 microlitros de tampão de dissociação celular e coloque os tubos em um banho de esferas pré-aquecido a 37 graus Celsius por 5 a 10 minutos. Em seguida, adicione 300 microlitros de meio básico organoide OSE humano e centrifugue a 240 G por cinco minutos. Finalmente, ressuspenda o pellet no volume desejado de solução de extrato de membrana basal não diluída para semeá-los novamente em uma proporção adequada para cultivo.
As células OSE humanas primárias exibiram morfologia semelhante a paralelepípedos até a passagem três, mas mostraram sinais de senescência depois disso. Os organoides OSE humanos de células OSE recém-isoladas cresceram mais do que os de células OSE expandidas 2D após 14 dias em cultura. Várias morfologias foram observadas em organoides 3D OSE, incluindo aglomerados de células císticas, monocamadas, multicamadas e não lumenizadas.
