Os métodos tradicionais de cultura difusal muitas vezes falham em recapitular o ambiente complexo dos órgãos vivos, levando à perda de marcadores e funções específicas do tecido. Desenvolvemos um chip de topo aberto que combina cultura difusal e princípio microfluídico para imitar de perto o microambiente dos tecidos epiteliais. Ao incluir pistas bioquímicas e biomecânicas que estão naturalmente presentes em órgãos vivos, mas muitas vezes negligenciadas pelos modelos tradicionais in vitro, o chip de topo aberto representa uma melhor alternativa entre sistemas fechados.
Quem demonstrará o procedimento será Adya Panchal hoje, estudante de pesquisa em meu laboratório. Para começar, traga os reagentes necessários sob o gabinete de biossegurança no gelo. Cultivar células mesenquimais tecido-específicas para obter 80% a 90% de confluência e, em seguida, dissociar as células usando tripsina ou outros métodos, de acordo com as recomendações do fabricante.
Pastilha as células a 250g por cinco minutos a 24 graus Celsius. Ressuspenda o pellet de célula em 225 microlitros cada de EMEM 10X gelado e tampão de reconstrução. Misture as células por pipetagem e adicione 1.800 microlitros de solução gelada de colágeno 1.
Em seguida, misture a solução de pré-gel no gelo, pipetando para cima e para baixo cinco a seis vezes. Neutralize a solução pré-gel com 18 microlitros de um hidróxido de sódio normal, misture suavemente por pipetagem e, em seguida, pipete 150 microlitros de hidrogel carregado de células para a câmara central do chip de topo aberto, evitando bolhas. Agrupe os chips em placas de Petri separadas, incluindo uma tampa de tubo de centrífuga preenchida com dois mililitros de água bidestilada estéril em cada placa de Petri, e incube as placas de Petri a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Para realizar a micropadronização superficial do hidrogel estromal, pipetar 20 microlitros da solução pré-gel de colágeno 1 neutralizada na superfície padronizada de um carimbo estéril impresso em 3D e inserir o carimbo dentro da câmara aberta enquanto o hidrogel estromal ainda está na forma líquida. Remova qualquer resíduo de hidrogel que possa derramar do topo da câmara aberta usando um aspirador. Agrupe todos os chips em placas de Petri separadas com uma tampa de tubo cônica cheia de água, conforme demonstrado anteriormente.
E incube todas as placas de Petri a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 90 minutos. No final da incubação, traga os cavacos de volta sob o armário de biossegurança e remova suavemente os carimbos usando pinças de precisão para reduzir o risco de danificar o hidrogel. Uma vez que as células cultivadas atinjam 80% a 90% de confluência, dissociar as células usando procedimentos enzimáticos proteolíticos recomendados pelo provedor de células.
Após a dissociação, pellet as células por centrifugação e ressuspensão das células epiteliais até a densidade de fragmentos celulares apropriada conforme descrito no manuscrito. Para semear a célula epitelial, transfira os cavacos da incubadora para o gabinete de biossegurança e lave a superfície do estroma três vezes com 100 microlitros de meio de cultura de células epiteliais fresco para remover qualquer excesso de solução de revestimento. Uma vez aspirado o meio de enxágue, semeie a superfície do hidrogel com 50 microlitros da suspensão de células epiteliais usando densidade celular apropriada e, em seguida, transfira os cavacos de volta para a incubadora por duas horas.
Para remover detritos celulares, lave suavemente a superfície do hidrogel com o meio de cultura celular duas vezes, renove o meio autoclavando em recipientes autoclaváveis selados e conecte os cavacos à bomba peristáltica. Pause a bomba peristáltica, desconecte cuidadosamente os cavacos da bomba e extraia o suporte da carcaça do chip. Após transferir os cavacos da incubadora para o gabinete de biossegurança, remova o volume do meio deixado no reservatório superior.
Em seguida, aspirar todo o meio do canal microfluídico superior suavemente e prender o tubo microfluídico curto conectado às entradas superiores usando clipes ligantes para reduzir a evaporação do meio e a manutenção da interface ar-líquido, ou ALI. Coloque o chip de topo aberto no suporte da carcaça de volta para a incubadora. Reconecte os cavacos à bomba peristáltica e retome o fluxo ligando a bomba peristáltica.
Enxaguar a câmara vascular com meio de cultura de células endoteliais e, em seguida, semear 25 microlitros de suspensão de células endoteliais. Vire os chips de cabeça para baixo para permitir que as células endoteliais se fixem à superfície superior da câmara microfluídica. Agrupe as batatas fritas em placas de Petri.
Coloque-os de volta na incubadora, como demonstrado anteriormente, e deixe as células endoteliais se fixarem por uma hora. Ao final da incubação, transferir os cavacos da incubadora para o gabinete de biossegurança e enxaguar o canal vascular com meio de cultura de células endoteliais duas vezes para remover debris celulares. Coloque os chips no plano para facilitar a adesão das células endoteliais à superfície inferior do canal vascular.
Preencher o reservatório do meio vascular com o meio de cultura de células vasculares desgaseificado sob a cabine de biossegurança. Coloque os cavacos de volta dentro da carcaça do chip e reconecte os chips aos reservatórios médios em uma extremidade e à bomba peristáltica na outra. Inspecione as conexões microfluídicas para garantir que todos os chips estejam conectados corretamente e que não haja gotículas visíveis de gotejamento médio.
Em seguida, retome o fluxo de fluido ligando a bomba peristáltica. A superfície de gel micropadronizada com e sem células é visualizada. A análise histológica revelou epiderme madura estratificada multicamada, diferenciada em chip.
A imagem de vista superior do chip cutâneo mostrou a presença dos fibroblastos no interior da camada dérmica. PECAM-1, VE-caderina e von Willebrand mostraram a diferenciação de células endoteliais microvasculares humanas co-cultivadas no chip cutâneo aberto. MUC5AC, tubulina alfa e beta, proteína clorocelular 16, p63 e coloração fluorescente ZO-1 mostraram epitélio maduro das vias aéreas.
Os cílios batedores e o epitélio pseudoestratificado maduro diferenciado foram observados no chip de via aérea aberto. As colorações fluorescentes tipo I, tipo II e E-caderina mostraram a presença de pneumócitos maduros no chip. A microscopia eletrônica revelou a presença de microvilosidades e vesículas lisossômicas, evidência de fenótipo alveolar maduro.
A análise histológica mostrou a presença de células escamosas planas, compatíveis com o fenótipo Tipo I, células cuboidais-tipo paralelepípedos coerentes com o fenótipo Tipo II, e fibroblastos no interior da camada dérmica. A presença de enterócitos e do cálice maduro foi confirmada pela coloração de mucina 2 e E-caderina. Os fibroblastos no interior da camada dérmica confirmaram a presença de um epitélio colunar simples.
Todos os reagentes devem estar frios e as superfícies do gel devem ser adequadamente enxaguadas para obter uma superfície uniforme. É importante remover quaisquer células e detritos não aderentes para obter adesão celular uniforme e uma monocamada e parede vascular compactas e fétidas. Uma abordagem semelhante pode ser empregada para gerar outros tipos de modelos de órgãos epiteliais, como intestino e pulmão, para avaliar como drogas específicas ou fatores ambientais podem afetar a homeostase dos tecidos humanos, com ênfase particular na função de barreira epitelial e vascular.
Com fácil acesso à fase de eficácia do compartimento do estroma, a pesquisa pode agora gerar padrões faciais específicos e reproduzir a arquitetura funcional do tecido, como o cryptviveoli, o que é difícil de alcançar com outros dispositivos.
