Mantenha células-tronco pluripotentes ou PSCs em placas de cultura de seis poços e confirme a densidade celular ao microscópio. Para diferenciação de cardiomiócitos ou CM, semeie PSCs em uma placa de cultura de 96 poços em um meio de preparação de PSC. No estágio um da diferenciação cardíaca, quando as CEPs atingirem 80 a 90% de confluência, troque o meio para o meio de diferenciação do CM com CHIR de dois a 20 micromolares.
Após 24 a 48 horas de tratamento com CHI, troque o meio por um meio de diferenciação de CM fresco. No estágio dois ou no terceiro dia, substitua o meio pelo meio de diferenciação CM suplementado com cinco IWR1 micromolares em cultura até o quinto dia. Em seguida, mude o meio para o meio de diferenciação do CM e mantenha-o até os dias seis a sete, quando as PSCs se diferenciam em células progenitoras cardíacas, ou CPC.
No dia 10 ou no dia 12, fixe as células com 4% de paraformaldeído em PBS por 15 minutos em temperatura ambiente. No momento da coloração, trate as células com uma solução permeabilizante por 30 minutos em temperatura ambiente. Incubar a amostra com anticorpo primário CTNT durante a noite a quatro graus Celsius.
Em seguida, trate a amostra com anticorpos secundários em PBS contendo 1% de albumina de soro bovino por uma hora a 37 graus Celsius. Depois de remover o anticorpo secundário das células, corar os núcleos por Hoechst por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, enxágue as células três vezes usando PBS antes de adicionar 100 microlitros de PBS por poço para evitar a secagem.
Para coletar imagens imunofluorescentes de campo claro e CTNT de diferentes estágios de diferenciação usando um microscópio automatizado que suporta cultura de células vivas, abra o software e crie um novo projeto experimental. Escolha uma objetiva 5X e uma mistura 2X2 para a imagem. No menu de canais, adicione o canal de campo claro TL para campo claro e os canais AF 488 e H 33 42 para imagens de imunofluorescência.
Modifique o caminho da luz na configuração da imagem. No menu Pilha Z, defina o número de fatias e intervalos durante a digitalização. Na janela de navegação e blocos, configure as regiões de blocos por transportadora e defina 25 blocos de cinco colunas em cinco linhas para um poço.
Para adquirir imagens, primeiro coloque a placa de cultura de células na bandeja de amostra e carregue a bandeja dentro do microscópio. Se a amostra consistir em células vivas, abra o sistema de aquecimento e a bomba de dióxido de carbono para manter as condições apropriadas para a cultura a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Abra o projeto experimental predefinido.
Abra o menu de blocos e calibre a posição da placa manualmente. Na janela de navegação e blocos, selecione os poços necessários e clique em criar para construir regiões de ladrilhos para esses poços. Clique em verificar regiões de bloco no menu de blocos e execute o foco automático para verificar todos os poços.
Em seguida, corrija manualmente o foco de cada poço. Clique no botão iniciar experimento e aguarde a geração automática de imagens. Normalmente, leva cerca de 1,2 horas para escanear uma placa de cultura inteira de 96 poços.
Na estrutura de processamento, escolha exportação de imagem, selecione o tipo de arquivo do formato TIFF descompactado ou formato PNG e aplique.
