Para começar, colete as mudas de Columbia-0 Arabidopsis de cinco dias congeladas, estressadas pelo calor e não tratadas, no recipiente de nitrogênio líquido. Moa as mudas usando um homogeneizador em pó por um minuto. Em seguida, adicione 500 microlitros de tampão de extração de polissomos ao tubo.
Inverta e vortex o tubo para misturar a amostra. Centrifugue a solução de extracção a 12 000 g durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, filtre o sobrenadante através de um filtro de células de 100 micrômetros para obter uma solução de extração límpida e livre de partículas.
Carregar o sobrenadante filtrado no gradiente de sacarose pré-preparado e aguardar até atingir o equilíbrio. Em seguida, ultracentrifugue o gradiente usando um rotor de caçamba oscilante a 210.000 G por 3,5 horas a quatro graus Celsius com taxas máximas de aceleração e desaceleração. O RNA não polissômico e polissômico são separados com base em sua densidade na solução de gradiente de sacarose correspondente.
Prepare a solução de perseguição para a bomba de seringa de microvolume composta por 70% de sacarose, 10% de glicerol e 0,02% de azul de bromofenol. Misture bem a solução por 30 a 40 minutos. Depois de injetar a solução de perseguição no gradiente, usando o software, controle o fracionador de gradiente de densidade.
Em seguida, calibre a máquina com água deionizada. Após a ultracentrifugação, coloque o tubo no fracionador de gradiente de densidade. Usando o sistema de perfuração do tubo, conecte o tubo à bomba da seringa e ao detector ultravioleta.
Mude o fracionador de gradiente de densidade para o controle remoto do modo de controle de software. Defina a taxa de fluxo de injeção da bomba de seringa de microvolume para três mililitros por minuto. Inicie o processo para obter o gráfico de perfil de polissoma medindo a densidade óptica a 254 nanômetros usando o fracionador.
Com base nas medições do perfil polissômico, coletar as frações de RNA não polissômica e polissômica separadamente. Misture bem as frações de RNA coletadas com solução pré-fria duas vezes com alto teor de sal. Em seguida, adicione oito microlitros de um estoque diluído de controle de RNA poli-A eucariótico do kit.
Centrifugue a solução de alto teor de sal de RNA misturado com um rotor de balde oscilante a 450.000 G por cinco horas a quatro graus Celsius. Despeje cuidadosamente o sobrenadante e lave o pellet de RNA três vezes com 500 microlitros de água pré-fria tratada com DEPC. Após a última lavagem, adicione 500 microlitros de reagente de extração de RNA à amostra de RNA.
Misture e incube por 10 minutos. Adicione 100 microlitros de clorofórmio e misture bem. Incube por 10 minutos para permitir a separação de fases.
Centrifugue a mistura a 12.000 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Transfira a camada aquosa transparente superior contendo RNA para um novo tubo e misture-a suavemente com um volume igual de isopropanol. Incubar a mistura a menos 20 graus Celsius por duas horas para precipitar o RNA.
Após a precipitação, centrifugue novamente e descarte o sobrenadante, deixando o pellet de RNA no fundo. Lave o pellet de RNA com um mililitro de etanol pré-frio a 75%. Centrifugue a 12.000G por 10 minutos a quatro graus Celsius e seque ao ar o pellet de RNA.
Após a secagem, ressuspenda o pellet em 30 microlitros de água tratada com DEPC. Meça a concentração de RNA usando um espectrofotômetro de espectro total de 220 a 750 nanômetros, com foco na densidade óptica de 260. O perfil polissômico mostrou uma separação distinta entre as frações não polissômica e polissômica em condições normais.
O estresse térmico a 40 graus Celsius reduziu significativamente a intensidade do sinal da fração polissomal, e esse efeito foi revertido após uma recuperação de duas horas a 22 graus Celsius, trazendo o sinal de volta aos níveis de controle. Os resultados da extração de RNA indicaram que o estresse térmico reduziu a porcentagem de RNA na fração polissomal, que foi restaurada após a recuperação a 22 graus Celsius.
