We are grateful to the past and present members of the laboratory, in particular Urszula Liwak, for critical discussion regarding polysome profiling protocols and sharing of data. This work was supported by operating grants from the Canadian institutes of Health Research, Cancer Research Society, and the National Science and Engineering Research Council of Canada to MH. MDF was supported by the Vanier Canada Graduate Scholarship Doctoral Award and the Ontario Graduate Scholarship, and this work forms part of her Ph.D. dissertation.

<ol>
	<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+by+which+cycloheximide+and+related+glutarimide+antibiotics+inhibit+peptide+synthesis+on+reticulocyte+ribosomes.">The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes.</a> J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).</li><li>Tscherne, J. S., Pestka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+protein+synthesis+in+intact+HeLa+cells.">Inhibition of protein synthesis in intact HeLa cells.</a> Antimicrob Agents Chemother. 8 (4), 479-487 (1975).</li><li>Damgaard, C. K., Lykke-Andersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+coregulation+of+5'TOP+mRNAs+by+TIA-1+and+TIAR.">Translational coregulation of 5'TOP mRNAs by TIA-1 and TIAR.</a> Genes Dev. 25 (19), 2057-2068 (2011).</li><li>Thakor, N., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRES-mediated+translation+of+cellular+messenger+RNA+operates+in+eIF2alpha-+independent+manner+during+stress.">IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress.</a> Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).</li><li>McKinney, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reprogramming+of+the+cellular+translational+landscape+facilitates+cytomegalovirus+replication.">Global reprogramming of the cellular translational landscape facilitates cytomegalovirus replication.</a> Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2014).</li><li>Jivotovskaya, A. V., Valasek, L., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+translation+initiation+factor+3+(eIF3)+and+eIF2+can+promote+mRNA+binding+to+40S+subunits+independently+of+eIF4G+in+yeast.">Eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF3) and eIF2 can promote mRNA binding to 40S subunits independently of eIF4G in yeast.</a> Mol Cell Biol. 26 (4), 1355-1372 (2006).</li><li>Gross, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+Loading+onto+the+mRNA+Cap+Is+Driven+by+Conformational+Coupling+between+eIF4G+and+eIF4E.">Ribosome Loading onto the mRNA Cap Is Driven by Conformational Coupling between eIF4G and eIF4E.</a> Cell. 115 (6), 739-750 (2003).</li><li>Graber, T. E., Baird, S. D., Kao, P. N., Mathews, M. B., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF45+functions+as+an+IRES+trans-acting+factor+that+is+required+for+translation+of+cIAP1+during+the+unfolded+protein+response.">NF45 functions as an IRES trans-acting factor that is required for translation of cIAP1 during the unfolded protein response.</a> Cell Death Differ. 17 (4), 719-729 (2010).</li><li>Spriggs, K. A., Stoneley, M., Bushell, M., Willis, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-programming+of+translation+following+cell+stress+allows+IRES-mediated+translation+to+predominate.">Re-programming of translation following cell stress allows IRES-mediated translation to predominate.</a> Biol Cell. 100 (1), 27-38 (2008).</li><li>Uniacke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oxygen-regulated+switch+in+the+protein+synthesis+machinery.">An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery.</a> Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).</li><li>Liwak, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppressor+PDCD4+represses+internal+ribosome+entry+site-mediated+translation+of+antiapoptotic+proteins+and+is+regulated+by+S6+kinase+2.">Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2.</a> Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).</li><li>Occhi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mutation+in+the+upstream+open+reading+frame+of+the+CDKN1B+gene+causes+a+MEN4+phenotype.">A novel mutation in the upstream open reading frame of the CDKN1B gene causes a MEN4 phenotype.</a> PLoS Genet. 9 (3), (2013).</li><li>Faye, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+composition+of+cellular+internal+ribosome+entry+sites+defines+dependence+on+NF45+and+predicts+a+posttranscriptional+mitotic+regulon.">Nucleotide composition of cellular internal ribosome entry sites defines dependence on NF45 and predicts a posttranscriptional mitotic regulon.</a> Mol Cell Biol. 33 (2), 307-318 (2013).</li><li>Zong, Q., Schummer, M., Hood, L., Messenger Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+translation+state:+the+second+dimension+of+high-throughput+expression+screening.">RNA translation state: the second dimension of high-throughput expression screening.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (19), 10632-10636 (1999).</li><li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+profiling+reveals+translational+control+of+gene+expression+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum.">Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biol. 14 (11), (2013).</li><li>Choudhuri, A., Maitra, U., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+initiation+factor+eIF3h+targets+specific+transcripts+to+polysomes+during+embryogenesis.">Translation initiation factor eIF3h targets specific transcripts to polysomes during embryogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9818-9823 (2013).</li><li>Corbin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fragile+X+mental+retardation+protein+is+associated+with+poly(A)++mRNA+in+actively+translating+polyribosomes.">The fragile X mental retardation protein is associated with poly(A)+ mRNA in actively translating polyribosomes.</a> Hum Mol Genet. 6 (9), 1465-1472 (1997).</li><li>Riley, A., Jordan, L. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+5'+UTRs+regulate+XIAP+expression+under+normal+growth+conditions+and+during+cellular+stress.">Distinct 5' UTRs regulate XIAP expression under normal growth conditions and during cellular stress.</a> Nucleic Acids Res. 38 (14), 4665-4674 (2010).</li><li>Thermann, R., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+miR2+induces+pseudo-polysomes+and+inhibits+translation+initiation.">Drosophila miR2 induces pseudo-polysomes and inhibits translation initiation.</a> Nature. 447 (7146), 875-878 (2007).</li><li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism.">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li><li>Graber, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivation+of+stalled+polyribosomes+in+synaptic+plasticity.">Reactivation of stalled polyribosomes in synaptic plasticity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16205-16210 (2013).</li><li>Wang, Y., Ringquist, S., Cho, A. H., Rondeau, G., Welsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+polyribosome+fractionation.">High-throughput polyribosome fractionation.</a> Nucleic Acids Res. 32 (10), (2004).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling:+new+views+of+translation,+from+single+codons+to+genome+scale.">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Perfilamento polissomal é uma técnica poderosa que permite a quantificação do estado da tradução de transcritos específicos sob diferentes condições de tratamento. É uma técnica muito simples, em princípio, no entanto, requer várias etapas de execução, alguns dos quais são críticos para produzir bons perfis de polissomas. Estes passos principais são: 1) uso de produtos químicos RNase e de plástico, 2) a preparar bons gradientes de sacarose (em nossa experiência de 10-50% gradientes de sacarose funcionar melhor para resolver de forma eficiente 40 / 60S subunidades e mRNAs com ribossomos ligadas), e 3 ) utilizando células que estão em crescimento exponencial e não confluentes mais do que 80%, a fim de capturar as maiores taxas de tradução. Este último passo deve ser tomado em consideração quando se faz tratamentos celulares longos, tais como o knockdown ou a sobre-expressão do gene, de modo que a quantidade de células a placa será uma função da quantidade de células vão ser confluentes no final do estudo. Nos resultados da presented aqui, polissoma análise do perfil era uma ferramenta importante para avaliar o papel de PDCD4 na regulação tradução dos IRES-abrigando mRNAs XIAP e Bcl-xL 12. O fato de que nós não observamos qualquer mudança nos perfis gerais polissomas sobre PDCD4 knock-down (Figura 1B) permitiu-nos concluir que PDCD4 não prejudicou tradução celular mundial nas condições do experimento. A seguir, utilizaram a análise de RT-qPCR para determinar a distribuição do XIAP e Bcl-xL ARNm em células tratadas com PDCD4 ou siRNAs de controlo. qPCR é um método de escolha para a análise de perfis de polissomas, em oposição ao padrão de RT-PCR ou Northern blotting, uma vez que permite uma análise quantitativa ao invés de semi-quantitativa da distribuição de ARNm e para a detecção de mudanças subtis na eficiência de translação entre os tratamentos. Usando esta técnica, fomos capazes de mostrar que a distribuição dos XIAP e Bcl-xL mRNAs (expresso como uma percentagem do total de mRNA-alvo em todo o gradient) foi significativamente deslocado para polirribossomas pesados ​​(mRNAs com um grande número de ribossomas associados com eles) após PDCD4 knock-down (Figura 1D, E), indicando, assim, um aumento na tradução destes mRNAs. Isto foi ainda confirmado por um aumento em XIAP e Bcl-xL, mas os níveis de proteína não nos seus níveis de ARN de estado estacionário (Figura 1F, G). É importante notar que a distribuição de polissoma a variante não-IRES de XIAP permaneceu inalterada entre as células tratadas e não tratadas (Figura 1C). Em alternativa, a eficiência de translação pode ser apresentada como uma proporção do teor de ARNm em polissomas (geralmente fracções 5 a 10) contra monosomes (geralmente frações 2-4) 14. O uso de controles durante todo o protocolo é importante para validar qualquer polissoma perfis resultado, como picos observados a partir de leituras de absorbância a 254 nm não pode em seu próprio ser atribuído ao RNA ribossomal (detergentes, tal como Triton X-100 absorvem fortemente nesta regi do espectro e pode obscurecer 40 / 60S picos no topo do gradiente). Gradientes em branco sem ligado e / ou com tampão de lisado precisa ser executado para determinar a contribuição relativa dos buffers para a absorvância a 254 nm. Artefactual estruturas de ordem superior também pode levar a interpretações errôneas dos polissomos onde há de fato nenhum (por exemplo, &quot;pseudo-polissomos&quot; 20). Sequestrar de magnésio (usado durante todo o procedimento para estabilizar ribossomas 80S) com o catião bivalente quelante EDTA adicionado ao lisados ​​e para o buffer de gradiente (20 mM durante 15 min) vai provocar a separação do ribossoma nos seus componentes pequenos (40S) e grandes (60S subunidades). Assim, se os picos de absorvância registados a 260 nm polissomas são, de facto, o tratamento com EDTA vai entrar em colapso o perfil de tal modo que uma única máxima vai ser observada perto do topo do gradiente que corresponde a libertar o ARNm e unidades ribossomais (dados não mostrados). Coincidentecom colapso induzido pelo EDTA do perfil, todos os alvos específicos analisados ​​por qPCR agora deve ser encontrada no topo do gradiente. O número de ribossomas associados a um ARNm não é sempre um indicador de quão eficiente de ARNm em particular que está a ser traduzida. Na verdade, existem contextos específicos em que a tradução se torna ativo em polissomos paralisadas 21,22 que o leitor deve estar ciente. Determinar se ou não transcritos estão activamente envolvidos com a maquinaria de tradução pode ser realizado por a) tratar a amostra com puromicina, que ao contrário de EDTA, faz com que &quot;run-off &#39;de ribossomas que estão activamente a translocação através de um mRNA, ou b) o tratamento da amostra com homoharringtonina que inibe a translocação de apenas a primeira ribossoma no codão de iniciação, de novo causando &#39;off-correr &quot;de quaisquer ribossomas translocar a jusante. O uso dos transcritos de controlo para análise qPCR também é crítico. A selecção de transcritos que não são afectados pelas diferentes condições de tratamento, tais como alguns genes de manutenção (GAPDH, actina, tubulina, nucleolina), ARNm ribossómicos, RPL13A (18S) ou, neste caso, a variante não-IRES do IRES de XIAP, é importante na verificar se o efeito do tratamento sobre a tradução é específica ou generalizada. Estes transcritos de controlo pode ser utilizado para normalizar a distribuição dos mRNAs analisada como foi feito aqui (XIAP e Bcl-xL mRNAs foram normalizadas para GAPDH mRNA e expresso como uma percentagem do conteúdo total de ARNm representado pela soma do teor de ARNm em cada fracção ) ou, alternativamente, os ARNm alvo e de controlo podem ser expressos como valores absolutos e mostrada separadamente. análise qPCR dos lisados ​​de entrada (geralmente 10% do volume total) é uma outra etapa que vai controlar a distribuição de mRNAs específicos. Idealmente, o conteúdo de um transcrito de ARNm específico no lisado de entrada deve ser comparável à soma do teor de ARNm em todas as 10 fracções analisadas. Finalmente, Um passo opcional para controlar o fenol: clorofórmio passo de extracção é a espiga cada fracção com um ARNm de polissoma repórter transcrito in vitro (tal como CAT, cloranfenicol acetil-transferase) que irá ser subsequentemente quantificados por qPCR e pode até mesmo ser utilizados para normalizar o dados 14. Como acontece com qualquer técnica, o profiling polissoma apresenta algumas limitações. O facto de normalmente um mínimo de 10 fracções (turnos de mais subtis em termos de eficiência de tradução podem exigir 20 ou mais) precisam de ser recolhido, a fim de ter distribuições de polissomas agradáveis ​​torna este passo limitante, no sentido de que apenas um máximo de 4 amostras pode ser analisados ​​de cada vez para ser capaz de lidar confortavelmente extracção de ARN e análise de qPCR de 40 amostras e os controlos de entrada 4 ao mesmo tempo. O tamanho da amostra pode facilmente adicionar até com quantos transcrições devem ser analisados ​​e quantos qPCR replica para fazer, e isso pode ser caro. Outra limitação de um polissomal profiling uma base-qPCRnálise é que ela só pode ser feito em uma abordagem baseada no candidato (onde os transcritos para serem analisados ​​são conhecidos de antemão) e não pode ser aplicado para a análise de todo o genoma de tradução. No entanto, no início do século 21, os investigadores começaram a interrogar o seu RNA polissomal em nível genômico usando DNA microarrays 15 e, mais recentemente, com a próxima geração de sequenciamento 16,17. Nesta abordagem poderosa, perfilamento polissomal é realizado como descrito no presente protocolo, excepto que em vez de efectuar a análise de qPCR de fracções individuais, monosomes fracções (geralmente de fracções 2-4) e polissomas fracções (normalmente fracções) são reunidas em conjunto e variações globais na tradução analisados por microarray de DNA ou todo o genoma RNA seqüenciamento. Assim, com esta abordagem, é possível avaliar todos os mRNAs cuja distribuição turnos de polissomos para monosomes (diminuição na tradução), ou vice-versa (aumento na tradução) após um tratamento específicomento. Validação e quantificação de ARNm específico polissomas distribuição pode, então, ser feito por qPCR. Um uso ainda mais poderoso do princípio da polissomal perfil é profiling ribossomo. Nova prorrogação alto rendimento desta técnica foi relatado recentemente que permite o monitoramento simultâneo de centenas de polissomas frações 23. Isso proporciona uma clara vantagem quando sondagem eficiência de translação de coleções mutantes ou em telas de RNAi em larga escala. Profiling ribossomo é uma técnica que aproveita a próxima geração de sequenciamento para mapear fragmentos de RNA protegidas por ribossomos (pegadas ribossomo) envolvidos na síntese de proteínas 24,25. Nesta técnica, a translocação do ribossoma pode ser inibida com ciclo-heximida (reversíveis) ou emetina (irreversível), seguida por lise celular e digestão de RNase para produzir uma população de pegadas ao ribossoma. Os ribossomas são enriquecidos, o ARN total é isolado, e contaminando ribossomal e RNA ribossomal mitocondrial é removido.Pegadas de RNA de aproximadamente 26-28 nucleotídeos são isolados, transcrição reversa, convertida em uma biblioteca de cDNA e seqüenciados 26. Ao contrário de perfis polissoma padrão, esta abordagem não só identifica mRNAs específicos que são regulados em translação, mas também fornece informações mRNA específico da resolução no códon tais como a ocupação exata e densidade dos ribossomos ao longo de uma transcrição específica. Isto é particularmente interessante para mRNAs com modos específicos de tradução, como mRNAs IRES-abrigam, como poderia dar mais informações sobre onde na transcrição ribossomo-recruitment está ocorrendo.

Regulação da síntese de proteína (tradução) é um processo celular fundamental que está intimamente ligada à sobrevivência celular. Dado que a tradução consome mais de 50% da energia da célula, não é de estranhar que a tradução é rigidamente controlado e que as perturbações na tradução não são bem tolerados. Por outro lado, muitos processos celulares aberrantes que requerem maquinaria de tradução e a saída da tradução (isto é, proteoma) tem de ser modificado. Este é frequentemente o caso em vários estados de resposta ao estresse e doenças, e é provavelmente o melhor exemplificado no câncer. Uma vantagem chave do controlo translacional é a capacidade das células para reprogramar a saída rápida de proteína em resposta a vários disparadores internos e externos, assim mecanismo de ajuste fino que inclina o equilíbrio entre morte celular e sobrevivência 1. Dois aspectos do controle de translação são particularmente interessantes; compreensão da natureza do mec regulamentarhanism (s) e elementos de controlo que permitem a tradução específico, bem como a identificação de mRNAs específicos e seus produtos proteicos que participam na resposta celular ao gatilho particular, que provocou a tradução selectiva em primeiro lugar. Perfilamento polissoma é uma técnica que permite o estudo eficaz de ambos os processos. O objetivo geral da técnica polissoma profiling é estudar e quantificar o estado de tradução de mRNAs específicos sob diferentes condições de celulares. O princípio da técnica é capturar tradução do mRNA por &#39;&#39; congelar &#39;&#39; traduzindo ativamente ribossomos em diferentes transcritos e separar os polirribossomas resultantes por ultracentrifugação em gradiente de sacarose, permitindo assim uma distinção entre as transcrições altamente traduzidos (ligado por vários ribossomos) e os mal traduzido (ligado por um ou dois ribossomos). Neste protocolo particular, o antibiótico ciclo-heximida que se liga ao60S da subunidade ribossômica e bloqueia a liberação de desacetilados tRNA do local E ribossomo 2, é usado para inibir a translocação ribossomo e parar ribossomos em mRNAs de tradução. No entanto, outros agentes bloqueadores, tais como emetina, que também bloqueia a tradução de alongamento 3, podem ser utilizados. Ao contrário da transferência western e 35 S-metionina técnicas de marcação que medem a saída final do processo de tradução, polissoma caracterização tem a vantagem de medir ribossomas associação com mRNAs activamente-traduzidas, permitindo, assim, para um estudo mais detalhado de mecanismos de tradução sob diferentes condições. Assim, a técnica pode ser facilmente adaptado especificamente para estudar a diferentes modos de tradução 4-6, factores de proteínas envolvidas na regulação de tradução 7-9, condições de stress que afectam a síntese de proteínas 1,10,11 ou os efeitos de estruturas de ARNm tais como IRES ou a montante quadros de leitura abertos no sintetizador de proteínasesis 12-14. Hoje em dia, polissomas aplicações de perfil são ainda mais ampla com o uso de microarranjos de DNA de 15 ou de próxima geração seqüenciamento 16,17 analisar polissomos-mRNAs associados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="772">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Gradient Master 108 automated gradient maker</td>
			<td style="width:135px;">BIOCOMP</td>
			<td style="width:119px;">107-201M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker</td>
			<td style="width:135px;">LABCONCO</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4517000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Beckman Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">Model # L-100-XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Density gradient fractionator</td>
			<td style="width:135px;">TELEDYNE ISCO</td>
			<td style="width:119px;">69-3873-246</td>
			<td>Composed of: tube piercing system,&#160; peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280nm filters and Foxy R1 Fraction Collector</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">WinDaq data acquisition software</td>
			<td style="width:135px;">DATAQ INSTRUMENTS</td>
			<td style="width:119px;">WINDAQ/LITE</td>
			<td>http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14x89 mm)</td>
			<td style="width:135px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose)</td>
			<td style="width:135px;">DiaMed</td>
			<td style="width:119px;">PRE1900-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom)</td>
			<td style="width:135px;">SafeSeal</td>
			<td style="width:119px;">12000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sucrose (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">573113</td>
			<td>MW = 342.3 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Cycloheximide</td>
			<td style="width:135px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">C7698</td>
			<td>MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sodium chloride (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">OmniPur</td>
			<td style="width:119px;">7710</td>
			<td>MW = 58.44 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">MgCl2.6H2O (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">OmniPur</td>
			<td style="width:119px;">5980</td>
			<td>MW = 203.3 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Tris Base (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">4109-01</td>
			<td>MW = 121.14 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:135px;">OmniPur</td>
			<td align="right" style="width:119px;">9400</td>
			<td>Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td style="width:135px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">RNaseZap Rnase inactivation solution</td>
			<td style="width:135px;">Ambion, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL)</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td style="width:135px;">Ambion, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9722</td>
			<td>Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of selective mrna translation in mammalian cells by polysome profiling

Regulação da síntese de proteínas representa um ponto de controlo chave na resposta celular ao stress. Em particular, os elementos reguladores discreta de RNA foram mostrados para permitir a tradução de mRNAs específicos selectiva, que tipicamente codificam para as proteínas necessárias para uma resposta de stress particular. A identificação destes mRNAs, bem como a caracterização dos mecanismos reguladores responsáveis ​​pela tradução selectiva tem sido na vanguarda da biologia molecular, por algum tempo. Perfilamento polissoma é um método fundamental nestes estudos. O objetivo do polissoma profiling é capturar tradução do mRNA imobilizando ribossomos traduzindo ativamente em diferentes transcritos e separar os polirribossomas resultantes por ultracentrifugação em gradiente de sacarose, permitindo assim uma distinção entre as transcrições altamente traduzidos e aqueles mal traduzidas. Estes podem então ser ainda caracterizada por métodos tradicionais de biologia molecular e bioquímica. Importante, combinando polysome perfis com abordagens genómicas alto rendimento permite uma análise em larga escala de regulação de translação.

Descrevemos recentemente um novo papel para o supressor de tumor PDCD4 como um inibidor selectivo de tradução de mRNAs que codificam inibidores apoptóticos XIAP e Bcl-xL 12 IRES-abrigando. Perfilamento polissoma foi uma técnica chave para demonstrar o envolvimento específico de PDCD4 na tradução IRES-mediada. As células HEK293 foram transfectadas transitoriamente para esgotar os níveis endógenos de PDCD4 (Figura 1A) e, em seguida, submetido a análise do perfil de polissoma. Observou-se que a redução dos níveis de PDCD4 não prejudicou tradução celular global, a julgar pela falta de mudanças no perfil polissoma quando comparando siCTRL e siPDCD4 células tratadas (Figura 1B). De modo semelhante, a distribuição de polissoma variante não-IRES de XIAP 19 permaneceu inalterada entre as células tratadas e não tratadas (Figura 1C). Em contraste, polissoma distribuição dos mRNAs dois IRES-albergando, XIAP e Bcl-xL, foi significativamente alterada. Na ausência de PDCD4 a distribuição destes dois mRNAs é deslocada para dentro ribopolysomes pesados ​​(Figura 1D, E). Uma vez que este não é acompanhada por alterações nos níveis de estado estacionário de XIAP e Bcl-xL de mRNA (Figura 1F), estes resultados demonstram tradução de XIAP e Bcl-xL reforçada em células com níveis PDCD4 reduzidas, que foi posteriormente confirmada por Western blot (Figura 1G). <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/52295/52295fig1highres.jpg" /> Figura 1:. Perfilamento polissoma identifica PDCD4 como inibidor selectivo de XIAP e Bcl-xL tradução (A) HEK293 células foram tratadas com siRNA PDCD4 ou controlo (CTRL), não-alvo siRNA, lisadas e sujeitas a análise de Western blot com anti-PDCD4 e anticorpos anti-nucleolina para verificar a extensão da PDCD4 knock-down. (B) PDCD4 foi derrubado como em (A) eOs lisados ​​celulares foram sujeitos a polissoma perfilamento. Polissoma perfil representativo é mostrado no painel de topo; a distribuição de XIAP não-IRES (C), Bcl-xL (D), e XIAP IRES (E) em relação ao ARNm que de GAPDH é mostrada como a percentagem de ARNm total (ARNm%) em cada fracção. (F) Firme Os níveis de ARNm -State foram medidas por RT-qPCR em PDCD4 siRNA ou de controlo (CTRL) siRNA células tratadas. (G) Os lisados ​​a partir de (A) foram também submetidas à análise de Western blot com anti-XIAP, anti-Bcl-x, e Os anticorpos anti-nucleolina. (NB. Os dados apresentados na Figura 1 foram originalmente publicado em 12) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52295/52295fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

Avaliação da Seletiva mRNA Tradução em células de mamíferos por polissoma Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

assessment-selective-mrna-translation-mammalian-cells-polysome

Research

JoVE Journal

Biology

27.9K visualizações.  University of Ottawa. The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions. 

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Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Análise de Cinética mRNA Nuclear Exportação em células de mamíferos por microinjeção

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Biologia

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Análise da posição do ciclo celular em células de mamíferos

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

Monitorando a replicação plasmídeo em células vivas de mamíferos longo de múltiplas gerações por microscopia de fluorescência

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. Alterations of this program can lead to the growth of damaged cells, a hallmark of cancer development, or to premature cell death such as seen in neurodegenerative diseases. Much of what is known concerning the molecular basis for translational control has been obtained from polysome analysis using a density gradient fractionation system. This technique relies on ultracentrifugation of cytoplasmic extracts on a linear sucrose gradient. Once the spin is completed, the system allows fractionation and quantification of centrifuged zones corresponding to different translating ribosomes populations, thus resulting in a polysome profile. Changes in the polysome profile are indicative of changes or defects in translation initiation that occur in response to various types of stress. This technique also allows to assess the role of specific proteins on translation initiation, and to measure translational activity of specific mRNAs. Here we describe our protocol to perform polysome profiles in order to assess translation initiation of eukaryotic cells and tissues under either normal or stress growth conditions.

Here, we describe a method to analyze changes in the initiation of mRNA translation of eukaryotic cells in response to stress conditions. This method is based on the velocity separation on sucrose gradients of translating ribosomes from non-translating ribosomes.

Análise da Tradução Iniciação Durante condições de estresse por polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Profiling Individual células estaminais embrionárias humanas por RT-PCR quantitativo

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Polysome Fracionamento e Análise de mamíferos Translatomes em uma escala genômica

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Medição dos Níveis de heme em células de mamíferos Síntese

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

Um método fácil para a planta polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

Sondando cinética mRNA no espaço e no tempo em Escherichia coli usando fluorescência de molécula única de duas cores na hibridização situ

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...