Isolamento e Processamento de Retinas de Montagem Inteira para Imunocoloração de Células Ganglionares da Retina de Camundongos

Depois de sacrificar o camundongo usando luxação cervical para enucleação e processamento do globo ocular, marque a borda da córnea no lado dorsal do globo ocular usando um marcador azul para garantir a orientação durante a dissecção. Usando uma tesoura, remova os tecidos musculares residuais presos ao globo ocular. Em seguida, transfira o globo ocular enucleado para um tubo de microcentrífuga de fundo redondo de dois mililitros preenchido com PBS.

Agora, coloque o globo ocular em outro tubo de dois mililitros contendo paraformaldeído a 4% recém-preparado para fixação a quatro graus Celsius por 10 minutos. Sob um microscópio de dissecação, use uma pinça fina para fazer uma pequena incisão na córnea. Coloque o globo ocular de volta no fixador e incube a quatro graus Celsius por três horas para preservar a morfologia do tecido.

Para remover a córnea e o cristalino, usando uma tesoura cirúrgica fina, faça uma pequena incisão de aproximadamente um milímetro ao redor do limbo da córnea, a borda entre a córnea e a esclera. Corte cuidadosamente ao redor da circunferência da córnea, extirpando-a inteiramente para expor as estruturas subjacentes. Em seguida, usando uma pinça fina, segure suavemente e levante cuidadosamente a lente dos tecidos circundantes para evitar danificar a retina.

Para a incisão escleral, corte uma fenda precisa na esclera com uma tesoura oftálmica fina para facilitar a dissecção subsequente. Em seguida, para a separação da retina, insira uma pinça dentada na incisão entre a esclera e a retina. Segure suavemente a borda da esclera, evitando força excessiva para evitar rasgar o tecido.

Aumente gradualmente a incisão movendo a pinça ao longo do limite entre a esclera e a retina. Use a parte do dente da pinça para separar cuidadosamente a esclera da retina sem danificá-la. Agora, usando uma tesoura afiada, divida a retina em quatro abas de tamanhos aproximadamente iguais.

Desdobre suavemente a retina dissecada com uma escova de cerdas macias e remova meticulosamente os detritos de sua superfície.